流式实验图有点难吗~小科教你轻松看懂!

目前常见流式图有一维直方图、二维散点图、等高线图、密度图等多种,小科这里主要对常见的流式图类型以及常见问题进行介绍。

01单参数直方图

每一个细胞单参数的测量数据可以整理成统计分布,以直方图的方式来显示。在直方图中,横坐标表示荧光信号或散射光信号相对强度的值,可以是线形或者对数,纵坐标一般是细胞数。利用直方图来设门分析,可得到细胞数目、门内细胞百分比等统计参量,总的来说单参数直方图只能表示具有同一特征细胞的数量及其细胞百分比等参数,对于多组分分析时,应该选择二维散点图进行分析。

图1.人外周血检测CD3实验

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直方图的横坐标通常表示荧光信号或散射光信号的相对强度值,从左到右表示信号强度从低到高。纵坐标代表相对细胞/粒子数,线越高表示该信号强度上的细胞/粒子数越多。

02二维散点图

前向散射(FSC)和侧向散射(SSC)是流式中两个非常基本的参数,FSC的值能代表细胞的大小,细胞的体积越大,其FSC就越大。SSC则代表细胞的颗粒度,细胞内细胞器和颗粒度越大,则SSC越大。所以可以利用FSC和SSC的特性对一些细胞进行区分,如图2,人外周血的细胞,通过FSC和SSC就可以区分为三群,该图属于流式细胞术中的散点图,即每一个点都代表了一个细胞。根据细胞大小和颗粒度的特征,可以把细胞分为淋巴细胞、单核细胞和粒细胞三群。

在流式操作过程中,最开始都会生成FSC/SSC散点图来观察细胞群的物理性质,通过该图可以圈出研究人员感兴趣的细胞群,在后续操作中做进一步分析。二维散点图能够表示两个独立参数与细胞相对数之间的关系,横坐标和纵坐标分别代表与细胞有关的两个独立参数,平面上每一个点表示具有相应坐标值的细胞。散点图是一种双变量描述,可被分为四象限,至少产生四种可能的结果来明确区分阴性和阳性。

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首先了解横(X)轴、纵(Y)轴各自所代表参数的意义;再看四个象限,并了解各象限意义;数据统计时,检测目的物一般用各象限区内的细胞数占门内细胞数百分比或平均荧光强度表示 。

03等高线图

流式等高线图与地理等高线图相似,都是利用闭合的环线来表示某一属性相等的区域。在流式等高线图中,这些环线代表的是细胞密度相同的区域。环线聚集越多的地方,表示细胞密度变化越快;环线的中央区域则代表细胞聚集的中心。能够较为直观地体现细胞的集中点,等密度环线的中央区域代表一个细胞群的集中点,一般代表一个细胞群。相较于流式散点图,流式等高线图在某些情况下更能直观地体现细胞的分群。

图4.正常C57小鼠脾脏淋巴细胞分群的流式等高线图。
(来源:网络)

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看图时,重点关注等高线的密集区与稀疏区,以及数值大小,这些信息将帮助你快速识别细胞群的聚集中心、边界和层次结构,为细胞分析提供有力支持。

Q&A

Q1:流式图中的颜色与荧光颜色是否一致?

A不需要一致,流式图中的颜色为人为指定,可以选择效果合适的颜色。

Q2:3中,阴性正好在101划分?

A流式细胞术中的阴性划分是基于实验设计和数据分析的需求来确定的,而不是基于一个固定的数字,比如图3中101,研究者通常会根据阴性对照来区分阴性和阳性细胞。

Q3:为什么要进行荧光补偿?

A主要是因为在多色荧光标记实验中,不同的荧光标记物常常发射在相似的波长范围内,导致光谱的重叠,会影响数据的准确性和解读。通过调节荧光补偿来修正荧光通道间的光谱重叠,确保实验结果的准确性和可靠性。

Q4:流式图中的阴/阳如何划分?

A流式图中的阴/阳划分实际上是基于阴性(同型)对照的荧光强度分布和统计学方法来确定。