流式细胞术之荧光知识

Post published:2021-07-26
Post category:流式抗体检测 / 生物资讯
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(一) 荧光知识
- 激发波长为 488nm 的荧光素
- 激发波长为 633nm 的荧光素
(二) 荧光素的选择

(一) 荧光知识

荧光素按激发光波长来分，主要是激发波长为375 nm、405 nm、488 nm和633 nm 4类，其中，常用的是激发波长为488 nm和633 nm的荧光素，如FITC、PE、APC、PI等。

激发波长为 488nm 的荧光素

异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）FITC是应用最为广泛的一种荧光素，经激光激发后发出明亮的黄绿色荧光，最大发射波长为525 nm。FITC的荧光强度受PH影响较大，常随着PH的降低而减弱，因此，在使用FITC时需格外注意溶液的酸碱度。
Alexa Fluor 488：Alexa Fluor是美国分子探针公司开发的系列荧光染料，Alexa Fluor 488的发射光谱与FITC几乎一致，经激光激发后发出绿色荧光，最大发射波长为519 nm，但其荧光强度和稳定性要优于FITC。一般来说，Alexa Fluor 488在pH 4-10范围内能保持较好的光稳定性。
藻红蛋白（phycoerythrin，PE）PE是从红藻中分离纯化获得的一种常见染料，经激光激发后发出橙黄色荧光，最大发射波长为575 nm。PE具有吸光性能好和光量子产率高的特点，可用于标记表达水平较低的蛋白。在流式细胞术检测中，PE标记的抗体适用于所有配备488 nm氩离子激光器的流式细胞仪。
PE-Cy5PE-Cy5是一种复合染料，属于藻红蛋白偶联物，在此类复合染料中，激发能量可从PE传递到Cy5上，最大发射波长为667 nm。由于PE-Cy5与FITC、PE在光谱上重叠范围较少，荧光干扰少，因此实验中常将PE-Cy5与FITC、PE搭配使用。需注意，PE-Cy5不适合与APC搭配使用，两者荧光重叠大。
PE-Cy5.5：PE-Cy5.5也是一种复合染料，能量从PE传递到Cy5.5上，最大发射波长为694 nm。同PE-Cy5不一样，PE-Cy5.5与FITC、PE、APC间荧光干扰小，可搭配使用，且其荧光强度要优于PE-Cy5。
PE-Cy7复合染料，最大发射波长为785 nm。PE-Cy7与FITC无光谱重叠，与APC重叠也较少，因此其可与FITC、PE、APC搭配使用。在实验中需要注意，PE-Cy7的光淬灭性很强，需要绝对避光环境。
PerCP-Cy5.5复合染料，最大发射波长为695 nm。与PerCP相反，PerCP的光量子产率较低，适用于表达水平较高物质的检测，PerCP-Cy5.5光量子产率高，可用于表达水平较低物质的检测。在双激光管仪器上与APC共同检测时，需要做补偿调节，但比PerCP补偿少。
PI/7-AAD：碘化丙啶（propidium iodide，PI）和7-AAD（7-amino-actinomycin D）的最大发射波长分别为617 nm和647 nm，是常见的荧光染料，常用于细胞凋亡检测，可用于鉴别死、活细胞。在大部分流式细胞仪上，PI在FL2或FL3通道检测，7-AAD在FL3通道检测。7-AAD同PI 有着相似的荧光特性，但其发射波谱较PI窄，对其他检测通道的干扰更小，在多色荧光分析中是PI的最佳替代品。

激发波长为 633nm 的荧光素

别藻青蛋白（allophycocyanin，APC）APC最大发射波长为660 nm，其标记的抗体适用于所有配备氦氖激光器的流式细胞仪，检测通道一般是FL4通道。FITC、PE和APC搭配是经典3色搭配。
Cy5：Cy5属于小分子染料，其最大发射波长为670 nm，其标记的抗体适用于所有配备633 nm氩离子激光器的流式细胞仪，检测通道一般是FL4通道。除流式细胞术外，Cy5同样适用于传统的荧光显微镜技术。需注意的是，Cy5与单核细胞和粒细胞的非特异性结合多，实验结果容易出现假阳性。
Alexa Fluor 647：Alexa Fluor 647是一种明亮的红色荧光染料，其最大发射波长为668 nm，一般在流式细胞仪的FL4通道检测。Alexa Fluor 647具有荧光量子产率高、光稳定性好、适宜的pH范围广和不易淬灭等特点，是APC和Cy5的优质替代品。