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作者：联科生物 发布日期：2016-08-16 14:00
Western样品电泳前需进行蛋白定量，以便保证蛋白上样量一致，有利于后续定量或半定量分析，常用的蛋白浓度测定方法有Lowry法、BCA法、Bradford法等，其灵敏度和所需的时间不同，且不同的方法会受不同干扰物质的影响，实验者可以根据样本制备方法（裂解液成分、去垢剂和还原剂种类等）自行选择。以下是几种方法的比较：
| 方法 |
原理 |
灵敏度 |
干扰因素 |
应用 |
| BCA法 |
基于双缩脲原理，碱性条件下蛋白质将Cu2+还原成功Cu，BCA螯合Cu作为显色剂，产生蓝紫色并在562nm有吸收峰，单价Cu与蛋白浓度在一定范围内呈现线性关系。 |
试管法： 20-2000ug/ml， 微孔法： 25-500ug/ml。 |
对SDS、Triton X-100、Tween 20、Tween 80等化学干扰物有很好的兼容性，但易受鳌合剂、还原剂、脂类物质及强酸、强碱条件的影响。 |
较快40分钟内完成， 较好， 抗干扰能力强。 |
| Bradford法 |
考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合呈蓝色，在波长595nm有吸收峰，其吸光值与蛋白含量成正比。 |
50 - 1000 μg/ml |
易受强碱性缓冲液TritonX-100，SDS等去垢剂的影响 |
快速5-15分钟， 颜色稳定， 深浅随不同蛋白质变化。 |
| Lowry法 |
蛋白质在碱性溶液中肽键与Cu2+螯合，形成蛋白质-铜复合物，还原酚磷钼酸产生蓝色化合物，蓝色深浅与蛋白质浓度呈线性关系。 |
较高5ug/ml |
适用于脂类含量较高的样品测定，也能耐受相当浓度的去垢剂如SDS。 |
40-60分钟， 操作要严格计时。 |
蛋白样本经过定量后，要制备电泳上样的样本，一般有以下几种情况：
A．变性、还原蛋白样本
一般的抗体只能识别抗原蛋白中的部分序列结构（表位），为使抗体能够达到结合该表位而需要将蛋白样本进行变性，使之打开折叠的空间结构。蛋白变性一般使用含阳离子去污剂如SDS的上样Buffer，并于95-100℃煮沸5分钟，SDS的阴离子环绕蛋白肽键使之带负电荷，蛋白分子量不同，结合的SDS数量不同，所带负电荷也不同，电泳迁移速度不同，SDS-PAGE电泳可以将不同分子量的蛋白分开。
B．天然和非还原样本
某些抗体识别的表位是非连续氨基酸构成的蛋白三维结构，此种情况需要进行非变性的WB，抗体的说明书一般会标注，这种非变性电泳不加SDS，样本也不需煮沸。某些抗体仅识别蛋白的非还原态，如某些Cysteine基的氧化态，因此Loading buffer和电泳液中不加入巯基乙醇和DTT。
| 蛋白状态 |
凝胶状态 |
Loading Buffer |
电泳缓冲液 |
| 还原—变性 |
还原和变性 |
有β-巯基乙醇或DTT和SDS |
有SDS |
| 还原—天然 |
还原和非变性 |
有β-巯基乙醇或DTT，无 SDS |
无SDS |
| 氧化—变性 |
非还原和非变性 |
无β-巯基乙醇或DTT，有SDS |
有SDS |
| 氧化—还原 |
非还原和天然 |
无β-巯基乙醇或DTT，无SDS |
无SDS |
Western电泳样品制备相关产品：
| 目录号 |
产品名称 |
规格 |
目录价 |
| PQ0011 |
BCA法蛋白定量试剂盒(50T/250T) |
kit |
240 |
| PQ0012 |
BCA法蛋白定量试剂盒(100T/500T) |
kit |
360 |
| PQ0021 |
快速型Lowry法蛋白定量试剂盒(50T/1000T) |
kit |
150 |
| PQ0022 |
快速型Lowry法蛋白定量试剂盒(100T/2000T) |
kit |
200 |
| PQ0031 |
抗干扰Lowry法蛋白定量试剂盒(50T) |
kit |
180 |
| PQ0032 |
抗干扰Lowry法蛋白定量试剂盒(100T) |
kit |
280 |
| PQ0041 |
Bradford法蛋白检测试剂盒（500T） |
kit |
60 |
| PQ0041 |
Bradford法蛋白检测试剂盒（1000T） |
kit |
100 |
| WB004 |
SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X) |
1 ml*2 |
30 |
| WB0041 |
非变性蛋白上样缓冲液(5X) |
1 ml*2 |
30 |
| WB0042 |
非变性非还原性蛋白上样缓冲液(5X) |
1 ml*2 |
30 |
|
