Western化学发光检测常见问题及解决方法

Post published:2016-10-12
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作者：联科生物发布日期：2016-10-12 09:00

底物化学发光ECL是Western blot最常用的显色方法之一，其原理是辣根过氧化物酶在H2O2的作用下，氧化化学发光物鲁米诺（Lumino）并发光，在化学增强剂存在下光强度可以增大1000倍，通过在照相底片上感光就可以检测辣根过氧化物酶的存在。

Fig：ECL发光检测原理示意图

ECL法具有操作简单，灵敏度高，线性范围广等特点，现将该方法使用中最常出现的问题以及解决方法汇总如下：

现象	原因	解决办法
信号弱或无	HRP过高引起底物迅速耗竭	稀释一抗/二抗
	抗体-抗原系统敏感性过低	提高抗体浓度/蛋白上样量
	转膜不充分/过转	优化转膜条件
	HRP或底物活性降低	测试活性或选用敏感底物
高背景	HRP过高(背景较高)	稀释一抗/二抗
	封闭时间不足	延长封闭时间4度过夜最好
	抗体与封闭液有交叉	更换封闭液(如3% BSA的TBST)
	TBST洗脱不足	增加洗脱时间、次数、用量
	曝光时间过长	降低曝光时间
	抗原-抗体浓度过高	降低抗体浓度或蛋白上样量
条带内无显影的白点	转膜不良（如有气泡在胶-膜之间)	精细操作
	膜平衡不均/油脂污染	按说明书平衡膜/戴手套用平头镊子持膜
	膜与X光片间有气泡	显影前去除气泡
非特异性条带	抗体交叉反应	稀释一抗/二抗
散在小圆斑	封闭液有杂质颗粒	静置牛奶使大颗粒沉淀，仅用上层
反影(白色条带,黑色背景)	HRP过高(背景较高)	稀释一抗/二抗
显影后膜上条带处变为黄色	HRP过高(敏感性太高)	稀释一抗/二抗

联科生物ECL显色试剂盒产品特点：
⇒ 高灵敏度的非放射性检测系统：可检测低至100fg～1pg的抗原，适用于痕量抗原的检测。

⇒ 高分辨率：本底极低，即使长时间曝光，背景仍然极低，远远优于国产与进口同类产品。

⇒ 半衰期长：信号衰减慢，12个小时以上仍可感光X光胶片。
ECL试剂盒产品列表：

目录号	产品名称	规格	目录价
P1421	Potent ECL Kit	60ml	300
P1423	Potent ECL kit	500ml	2000
P1425	Potent ECL kit	100ml	480
P142B	Potent ECL Bulk	1L	3600
P142S	Potent ECL Sample	10ml	50
U1421	Ultra ECL kit	60ml	360
U1423	Ultra ECL kit	500ml	2400
U1425	Ultra ECL kit	100ml	560
U142B	Ultra ECL Bulk	1L	4200
U142S	Ultra ECL sample	10ml	60

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目录号	产品名称	规格	目录价
DY01	定影粉（1L）	包	20
XY01	显影粉（1L）	包	20
WB001	X射线摄影暗匣（含高速增感屏）127*178mm	个	480
WB002	X射线摄影暗匣127*178mm	个	400
WB003	RB-400高速增感屏127*178mm	个	180
X1111	KODAK X光胶片	100张/盒	298

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