Western Blot 常见问题分析（三）

前两周的“Western Blot 常见问题分析”中，我们主要分享了一些异常的实验结果，今天我们来讲讲关于Western Blot实验可能会存在的疑惑。话不多说，直接上货：

1．Western实验中，用TBS还是PBS？
选择合适的缓冲液对于维持一定pH值下蛋白质的稳定及保证实验的重复性很重要。PBS的缓冲能力强于TBS，TBS在pH7.0以下缓冲能力较弱。一般根据实验目的选用合适的缓冲液，如在蛋白纯化中进行阴离子交换层析，阳离子缓冲液选TBS；阳离子交换层析时，阴离子缓冲液选PBS。Western blot中使用PBS和TBS均可，根据需要选择合适的浓度。
2. 没有注明可以用来做Western blot的一抗，可以用来做Western blot吗？

不一定，因为有的抗体是识别线性表位的，有的是识别构象型表位，识别构象型表位的抗体不能用于Western blot，因为在Western blot中抗体识别的是完全变性的蛋白质抗原，而蛋白质抗原的构象型表位变性时被破坏。

3．做Western每次只加一种一抗，可以同时加两种或者多种一抗吗？

最好不要同时加两种一抗，因为如果结果里面有非特异性信号的话，就说不清楚。做Western在同一张膜上检测目的蛋白和内对照，也是先上目的蛋白的一抗、二抗、ECL显色、压片、洗片，漂洗后加内对照的一抗、二抗、ECL显色、压片，洗片。

4. Western用的一抗，单抗好些还是多抗好些？

做Western来讲，理论上单抗比多抗的特异性要好但价格偏高，一般来说多抗就OK了。用于Western的抗体和用于ELISA的抗体，一般来说用于Western的抗体识别的是氨基酸序列特异性，而可用于ELISA的抗体要看抗原种类，有些是识别氨基酸序列特异性，有些是识别构象特异性，所以一般根据说明书来确定。做免疫印迹选择抗体主要考虑两个问题，一是所选抗体是否识别凝胶电泳后转印至膜上的变性蛋白，另一个是所选抗体是否会引起交叉反应条带。

5. 半干转是否要取膜、滤纸、胶同样大小，因为胶大小不一定规则，膜和滤纸会大一点，那样会不会短路？

可以相等，但是如果滤纸、膜比凝胶大就比较容易形成短路了，上下两层滤纸也不能因过大而相互接触，这样会短路，电流不会通过胶和滤纸。转移前和转移过程中看看电压就行，正常的半干转是慢慢变高的，最后结束时一般是开始的1.5-3倍都是正常的。

6. 不能很好的将大分子量蛋白转移到膜上，转移效率低怎么解决？

大分子量蛋白倾向于在胶里沉淀，阻碍转移。可以考虑：在转膜缓冲液里加入终浓度0.1%的SDS有助于增加转移效率；转移缓冲液中加入20%甲醇，甲醇可以降低蛋白质洗脱效率，增加蛋白质和NC膜的结合能力，防止凝胶变形，延长大分子量蛋白转移时间；用4℃湿转过夜代替半干法转膜。