世界上首次获得基因敲入的食蟹猴

由于基因修饰猴模型可以用于模拟人类疾病症状，因此它可以作为研究人类疾病机制和推进临床治疗的工具。然而，由于普通猴具有繁殖周期长(5-6年一代)，幼仔数量少（每胎一只）以及基因编辑效率低等特点，导致构建靶向基因编辑猴具有很大的困难和挑战性。最近的一些研究表明，CRISPR/Cas9系统可以用于构建基因敲除猴。然而，与基因敲除相反，由于种种原因例如效率低，到目前为止仍然还没有基因成功敲入猴的报道。

基于实验室之前的研究，同源臂介导的末端接合（HMEJ）的方法可以有效地在猕猴胚胎上实现高效的靶向基因整合。研究人员进一步优化受精卵注入条件，包括供体质粒浓度以及注射剂量，期望在提高敲入效率的同时保持正常的胚胎发育，进而获得基因敲入的猴子。具体来说，研究人员在Actb (β-actin) 位点插入p2A-mCherry以实现mCherry在Actb启动子的控制下表达。在经历完整的怀孕周期后，研究人员成功地获得了一对双胞胎猴（#1，雄；#2，雌）和三只单胎的雌性猴 (#3、#4和#5)。通过直接表皮荧光观察两只新生猴(#1,#5)的脚趾发现，与野生型相比，#1和#5展现出mCherry荧光(图A)。对两只死亡雌猴子(#2，#3)的各个组织进行切片观察，发现尾巴、脚趾、心脏、肌肉、心脏、肾、大脑和卵巢均显示出不同嵌合程度的mCherry表达。值得注意的是，研究人员在卵巢的大部分区域都检测到mCherry的表达，说明基因敲入猴子具有生殖系传递的可能性(图 B)。所有组织的PCR鉴定测序结果都表明在5’和3’连接处的整合是正确的。此外，Southern印迹分析进一步证实# 2和# 3猴的基因整合是正确的且没有额外的基因随机整合。

综上所述，研究人员利用CRISPR/Cas9介导的HMEJ策略，通过一细胞胚胎注射首次成功地获得了基因靶向整合的食蟹猴。基于其强大的DNA敲入效率和高保真性，HMEJ介导的敲入策略为构建靶向基因修饰的猴模型提供了可能性。