生物学新进程：首个外泌体癌症诊断产品上市

20 世纪 80 年代首次描述的外泌体是所有活细胞都能分泌的一种微泡。胞内体膜与细胞质膜融合后将其内包含的微小膜泡释放到细胞外形成外泌体，而不是与溶酶体融合被内部消化。它们包含胞质环境中富含的 DNA，RNA，蛋白质和其它分析物；所以它们的内含物成分与其细胞来源有关。“他们就像亲本细胞生产的产品”，位于波士顿的哈佛医学院放射学教授和系统生物学教授拉尔夫·惠斯勒说。

从患者血液中取得的微泡包含足够的 RNA 用来分析和作为诊断使用。Exosome Diagnostics 公司开发的 ExoDx Lung（ALK）产品可检测五种不同的突变，这些突变都是 EML4 和 ALK 两个基因间的融合突变，每一种突变可产生一种类型的非小细胞肺癌（NSCLC）。因为这些突变是 ALK 抑制剂敏感的，例如 Xalkori（crizotinib）和 Zykadia（ceritinib），这些突变的鉴定可以指导治疗方案的决定。像 ExoDx 这样基于外泌体 RNA 的分析诊断是一种创伤小的速效方案，可替代传统需要肿瘤活组织检查的免疫荧光或免疫组织化学检验方法。以外泌体为基础的诊断使得在癌症病情发展过程中可及时监测分子标志物的变化，这种基于血液样本的检测比重复的组织活检更容易监控，样本更容易收集。是什么触发细胞分泌外泌体仍是未知的，但科学家长期观察发现这些直径 30-100 纳米之间的微泡最后都到了大多数体液中，包括血液、尿液、唾液和乳汁等。“到目前为止，被研究的每一种细胞都可以分泌细胞外囊泡和外泌体，”Codiak 联合创始人兼非执行董事 Raghu Kalluri 说，他同时也是德克萨斯大学 MD 安德森癌症中心癌症生物学系主任（为了保证信息的透明，他补充说，他在 Codiak 持有股权且他的实验室可从该公司获得资助）。

创造“外泌体”一词的第一篇论文揭示了它们有一定的生理功能（Biochim. Biophys. Acta. 645, 63–70, 1981），但在未来的几十年中，它们在很大程度上被认为是细胞碎片的传播者和多余的大分子。外泌体的研究仍然是一个小众的追求，直到由瑞典哥德堡哥德堡大学的 Jan Lötvall 领导的研究小组报告说，外泌体可作为细胞之间的基因交流的一种新的机制，可转移功能性 RNA 分子，包括 mRNA 和 miRNA 等（Nat. Cell Biol. 9, 654–659, 2007）。这一发现激起了人们对外泌体领域的兴趣，现在形成 Codiak 知识产权（IP）资产基础的一部分。 Lötvall 是 Codiak 公司的科学顾问。

不久之后，位于波士顿的马萨诸塞州综合医院研究人员 Johan Skog，现在是 Exosome Diagnostics 公司的科学的创始人和 CSO，在一项研究中发现外泌体可以通过转移 miRNA 与血管生成相关蛋白促进肿瘤的生长，这些还可以提供基于血液的诊断信息（Nat. Cell Biol. 10, 1470–1476, 2008）。

外泌体作为细胞间通信载体的作用现在已被普遍接受。 “最需要理解的重要事情是外泌体可以到达体液可到达的任何地方，便可以进入几乎任何组织” Kalluri 说。

外泌体是相当惰性的，但它们与细胞膜融合可将所携带的物质和信号传递到受体细胞并改变其生物学功能，因此是纳米药物递送或基因治疗的潜在载体。“这些东西的行为有点像包膜病毒”，Biogen 研发的前任执行副总裁，现就职与 Codiak 的 Williams 说。外泌体甚至有作为癌症疫苗的潜力，从抗原呈递细胞来源的外泌体含有完整主要组织相容性复合物，并且能够抗原呈递（J. Immunol. 193, 1006–1011, 2014）。

外泌体诊断应用的另一个关键点就是胰腺癌。最近的 250 例患者的研究中，Kalluri 及其同事发现细胞表面蛋白多糖磷脂酰肌醇聚糖 -1（GPC1）在胰腺癌个体血液外泌体中含量特别丰富。GPC1 能够以 100%的准确率和敏感性诊断出早期和晚期胰腺癌（Nature 523, 177–182, 2015）。这种在分子诊断领域闻所未闻的精准水平听起来好得令人难以置信。“当然，那是我的第一反应，”Williams 说，但是这些数据已证明这是一个“非常有说服力的故事”，即使该发现在这一点上仍是初步的，且需要被别人重复的。

广泛的液体活检类别除了外泌体还包括循环肿瘤细胞和从死亡肿瘤细胞中释放的无细胞循环肿瘤 DNA（ctDNA）。这一领域的市场预测达数十亿美元，最近已有一些市场应用活动启动。近日，位于圣地亚哥的 Illumina 凭借其所谓的“超深度测序”检测 cfDNA 的应用募集到 1 亿美元的风投。另外一家也位于圣地亚哥的公司 Molecular Stethoscope 着眼于利用循环无细胞 RNA 早期检测和监控神经变性疾病、冠状动脉病和自身免疫性疾病。

外泌体 ExoDx Lung（ALK）测试可一步同时检测外泌体 RNA 和 ctDNA。“之前没有人能同时利用两个参数，” Skog 说。利用外泌体的诊断可在检测罕见癌症基因突变上提升诊断灵敏度，尤其是在基于循环肿瘤细胞或 ctDNA 等液体活检时不易检测到的情况下。在 m0/m1a NSCLC 患者双盲试验中，其基因突变状态被认为是特别难以用液体活检进行评估，与仅有 ctDNA 分析相比，外泌体 RNA 和 ctDNA 两者结合可将灵敏度提高近三倍以上（74%对 26%）。该测试是该公司计划将在今年在马萨诸塞州剑桥市的设施开展的测试总量的四分之一，这是得到美国医疗保险和医疗补助服务中心运行的临床实验室改进修正案（CLIA）质量计划认证的。

考虑到这个领域尚不成熟，科学家们还没有标准化用于分离和分析外泌体方法。大多数学术研究人员依靠超速离心分离外泌体，这种技术不方便、不适合大多数临床场所。Exosome Diagnostics 正在研发两种可供选择的方法。一个研究方案是基于离心柱核酸纯化的，另一个是基于动态药品生产管理规范（cGMP）的、涉及定量 PCR 的。通量在这一点上已不是问题了，Skog 说，“我们现在有一个中等通量检测方法，可以很容易一天做到几百个样品。”

目前总部设在马萨诸塞州剑桥市 LabCentral 的初创公司 Ymir Genomics 开发了从尿液中分离细胞外囊泡和细胞外核酸的两种高产量方法。一种是基于一种新的特异分子使它们以沉淀；另一种是基于一个广泛使用的树脂捕获法。联合创始人兼 CSO P. Shannon Pendergrast 说：“大多数分离方法的开发主要在血浆和血清，尿的一直很少有人做”。“在血清和血浆的外泌体分离工作是较容易的，因为其细胞外囊泡的浓度高得多，据报道要高 1000 倍以上。”尿有几个优点：获得样品比取血样侵入性更低；此外，外泌体是在尿中于室温下稳定长达一周。Weissleder 研究组集中于分析外泌体的蛋白质，而不是核酸。在临床试验中分离和分析外泌体可以很容易地部署在医疗点以测试新方法。一个是基于一个磁 - 电化学传感器（ACS Nano. 10, 1802–1809, 2016）。另一个涉及表面等离子体共振（SPR）芯片，称为纳米等离子体外泌体（nPLEX）传感器，它使用具有结合亲和配体“纳米孔”的金属 - 薄膜阵列检测预先规定的外泌体蛋白（Nat. Biotechnol. 32, 490–495, 2014）。外泌体作为治疗剂仍处于很早期的阶段，但最合乎逻辑的路径，Williams 说，就是用外泌体递送治疗药物。MD 安德森计划在今年年底推出第一阶段的研究，建立动物模型。Williams 还认为外泌体可能具有天然的靶向特定组织的特性，并且可以通过修改其生产细胞系重新改变他们的选择性。一个重要的证据就是，纽约威尔康乃尔医学院 David Lyden 实验室研究表明，不同细胞分泌的外泌体拥有不同的整合素类型，从而靶向不同的器官，影响特定器官转移前微环境的形成（Nature 527, 329–335, 2015）。该研究提供了在使用特定外泌体整合素阻滞剂可对抗癌症转移概念的体内证据。

虽然外泌体生物学仍然不成熟，但越来越多的兴趣和资金被吸引过来，这将加速其成熟。 早期的推动者拥有一个额外的动力 Weissleder 说：“这是一个全新的领域。” 目前他们是否会获得回报仍然是一个悬而未决的问题。

参考文献：Sheridan, C. (2016). "Exosome cancer diagnostic reaches market." Nat Biotechnol 34(4): 359-360. IF= 41.514