PCR常见问题分析及对策

问题1：无扩增产物 ( 现象：正对照有条带，而样品则无)

原因：

1. 模板：含有抑制物，含量低
2. Buffer对样品不合适
3. 引物设计不当或者发生降解
4. 反应条件：退火温度太高，延伸时间太短

对策:

1. 纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量
2. 更换Buffer或调整浓度
3. 重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物
4. 降低退火温度、延长延伸时间

问题2：非特异性扩增 ( 现象：条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带 )

原因：

1. 引物特异性差
2. 模板或引物浓度过高
3. 酶量过多
4. Mg²⁺浓度偏高
5. 退火温度偏低
6. 循环次数过多

对策：

1. 重新设计引物或者使用巢式PCR
2. 适当降低模板或引物浓度
3. 适当减少酶量
4. 降低镁离子浓度
5. 适当提高退火温度或使用二阶段温度法
6. 减少循环次数

问题3：拖尾 ( 现象：产物在凝胶上呈Smear状态。)

原因：

1. 模板不纯
2. Buffer不合适
3. 退火温度偏低
4. 酶量过多
5. dNTP、Mg²⁺浓度偏高
6. 循环次数过多

对策：

1. 纯化模板
2. 更换Buffer
3. 适当提高退火温度
4. 适量用酶
5. 适当降低dNTP和镁离子的浓度
6. 减少循环次数

问题4：假阳性 ( 现象：空白对照出现目的扩增产物 )

原因：
靶序列或扩增产物 的交*污染
对策：

1. 操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；
2. 除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管 及加样枪头等均应一次性使用。
3. 各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。

联科生物推荐一款试剂PCR Mix：

1. 含有Taq酶和高保真酶，既保证扩增效率，又大大降低错配几率可同时满足短片段和长片段产物的扩增；
2. 已混合好dNTP、Mg²⁺、酶、缓冲液体系，加模板、引物稀释到合适体系就可，模板浓度、纯度不用太担心。

不同浓度模板用本试剂进行PCR扩增，模板浓度高至20ng，低至0.16ng，都能扩增出较好的条带。模板浓度：1、20ng 2、4ng 3、0.8ng 4、0.16ng

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