Th17检测有困难？这份攻略帮你解决

通常所说的Th17是指在各种生理与病理条件下有能力分化为Th17的辅助性T细胞 (严格意义上是Th0)。当受到外界因素(如刺激素、病原体等)刺激，Th0即会向Th1、Th2、Th17等Th细胞分化。此时，通过检测分泌的细胞因子（如IFN-γ、IL-4、IL-17等）实现对各类Th细胞的检测。Th17主要分泌IL-17、IL-22等促炎因子，介导自身免疫性疾病和炎症反应。

静息状态下Th0分化为Th1、Th2、Th17等的能力非常弱，且流式细胞仪无法检测分泌到细胞外的细胞因子。因此，检测Th细胞时需要添加刺激剂及阻断剂。

通常使用的刺激剂为PMA(佛波酯)+Ionomycin(离子霉素)，也可使用CD3/CD28协同刺激、PHA刺激等来活化T细胞。实验表明，PMA为广谱刺激剂，即T细胞中的各亚群均会被PMA同等激活，而CD3/CD28协同刺激和PHA刺激，则是通过TCR受体的作用，仅对部分T细胞亚群有效。所以可根据实验的设计来选择刺激方式。通常选用的阻断剂为Brefeldin A (BFA, 布雷非德菌素 A)和/或Monensin (莫能霉素)，通过破坏高尔基体来切断细胞因子的转运途径，干扰其分泌。

另外，实验过程中涉及到如何正确的选定Th（即辅助性T细胞）的问题。Th细胞的表面标志为CD3+CD4+，而当用PMA刺激4小时时，会发现CD4+的细胞明显减少，甚至消失，这是因为PMA会诱发细胞表面CD4分子被内吞。所以通常的做法是用CD3和CD8反设CD4细胞，即CD3+CD8-的细胞被认为是CD3+CD4+的细胞。（注：PMA对小鼠CD4的影响很小，所以检测小鼠Th17时可用CD4直接设门）。

Th17检测步骤

样本制备

全血标本：

用肝素抗凝管采集静脉血（必须用肝素钠抗凝，不可用肝素锂、EDTA或枸橼酸钠）1-2ml，血液室温或4℃放置，8小时内必须进行检测，否则需弃用。

外周血单个核细胞（PBMC）标本：

1. 对于使用其它抗凝剂（如EDTA或枸橼酸钠）抗凝血，采集静脉血至少1ml，采集后4小时内使用；

2. 加入等体积的Hank’s液或不含Ca2+和Mg2+的PBS或生理盐水稀释血液；

3. 取1ml淋巴细胞分离液加入离心管中；

4. 将稀释血液小心地加到淋巴细胞分层液上，注意保持两者界面清晰；

5. 室温下，1500r/min，离心15分钟；

6. 用毛细吸管轻轻吸出单个核细胞层，加入含有4-5ml Hank’s液或不含Ca2+和Mg2+的PBS或生理盐水的试管中，充分混匀；

7. 1500r/min，离心10分钟，弃上清后，再洗一次；

8. 弃上清，用含10%胎牛血清的培养基重悬单个核细胞，用台酚兰染色计数活细胞数（应在95％以上）；

9. 调节细胞浓度为1x107/ml。

刺激效果检测（选做）

1、 全血标本：取125μl抗凝血至流式管中，加入125μl不含血清的培养基稀释到250μl；PBMC标本：用含10%胎牛血清的培养基重悬单个核细胞，用台酚兰染色计数活细胞数(应在95％以上)；调节细胞浓度为1×107/ml，取250μl；

2、在标本中加入1μl 250×PMA/Ionomycin，混匀；

3、37℃，5% CO2培养箱培养4-6小时，期间注意相隔1-2小时混匀一次；

4、取100μl样本，加入Human CD3（或 Mouse CD4）和CD69PE（用量详见说明书），室温孵育20分钟（全血样本溶血）后，用流式染色缓冲液洗一遍，300g离心5分钟，弃上清，用流式染色缓冲液重悬至500μl，上机检测；

5、CD3+（或CD4+）细胞中，CD69的阳性率应达到90%以上，进行下一步正式实验。

正式试验

全血标本：取125μl抗凝血至流式管中，加入125μl不含血清的培养基和1μl PMA/Ionomycin Mixture（250×）和1μl BFA/Monensin Mixture（250×）。取125μl抗凝血和125μl不含血清的培养基，作为对照。混匀，37℃孵育4-6小时，每隔1-2小时取出震荡混匀；

PBMC标本：用含10%胎牛血清的培养基重悬单个核细胞，使细胞浓度为1×107/ml。取250μl PBMCs至流式管中，加入1μl PMA/Ionomycin Mixture (250×)和1μl BFA/Monensin Mixture (250×)。以只含PBMCs的样本作为对照。混匀，37℃孵育4-6小时，每隔1-2小时取出震荡混匀；

注：PMA/Ionomycin Mixture (250×)和 BFA/Monensin Mixture (250×)极易挥发，使用后请及时旋紧管盖。

2. 从样本管和对照管中取100μl细胞悬液至新的流式管中，加入5μl Anti-Human CD3, FITC 和5μl Anti-Human CD8α, PerCP-Cy5.5（或加入5μl Anti-Mouse CD3ε, FITC 和5μl Anti-Mouse CD4, PerCP-Cy5.5）。震荡混匀，室温避光孵育15分钟；

3. 每管加入100μl FIX & PERM Medium A，震荡混匀，室温避光孵育15分钟；

4. 用蒸馏水将10×Flow Cytometry Staining Buffer稀释为1×，每管加入2ml预冷1×Flow Cytometry Staining Buffer，300×g离心5分钟，弃上清；

注：液体尽量倒干净，不要有残留。

5. 每管加入100μl FIX & PERM Medium B和5μl Anti-Human IL-17A, PE（或5μl Anti-Mouse IL-17A, PE）。震荡混匀，室温避光孵育15分钟；

6. 每管加入2ml 1×Flow Cytometry Staining Buffer，300×g离心5分钟，弃上清；

7. 每管加入500μl 1×Flow Cytometry Staining Buffer 重悬，上机检测；或者加入500μl 1-4 %多聚甲醛重悬，2-8℃避光，于24小时内检测。

结果示例

使用Mouse Th17 Staining Kit进行流式检测。正常ICR小鼠的静息肝素抗凝血(A0)、EDTA抗凝血来源的PBMCs (B0)、脾细胞(C0)和脾单个核细胞(D0)染色IL-17A。正常ICR小鼠的 PMA/Ionomycin刺激的肝素抗凝血(A1)、EDTA 抗凝血来源的 PBMC(B1) 脾细胞(C1)和脾单个核细胞(D1)染色IL-17A。对CD3+/CD4+细胞进行设门分析。

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