1、 按照联科生物 “人Th1&Th2 检测方法”或“小鼠Th1&Th2 检测方法”制备样本；
2、 准备6份样本，按以下浓度加入刺激剂和阻断剂，37 ℃ 5% CO2 培养4~6小时（不要超过6小时），中间混匀几次。
| 1）PMA 25ng/ml Ionomysin 1ug/ml |
2）PMA 125ng/ml Ionomysin 1ug/ml |
3）PMA 250ng/ml Ionomysin 1ug/ml |
| 4）PMA 25ng/ml Ionomysin 1ug/ml BFA 10ug/ml (或monensin 1.7ug/ml) |
5）PMA 125ng/ml Ionomysin 1ug/ml BFA 10ug/ml (或monensin 1.7ug/ml) |
6）PMA 250ng/ml Ionomysin 1ug/ml BFA 10ug/ml (或monensin 1.7ug/ml) |
注：浓度梯度可自由调整，以获得最佳的刺激浓度
3、 将刺激后的血样分别做流式检测
第一管：正常样本未刺激 CD4+胞外CD69
第二管：1）样本 CD4+胞外CD69
第三管：2）样本 CD4+胞外CD69
第四管：3）样本 CD4+胞外CD69
第五管：5）样本 CD4+胞外CD69
以上五管处理方法：
每管加100ul刺激后的细胞，按说明书加入适量的CD4和CD69抗体，室温避光孵育15min。
用2ml预冷PBS洗一次，300g离心5min，弃上清。
用500ul PBS 重悬细胞，上机检测
第六管：4）样本 CD4+胞内CD69
第七管：5）样本 CD4+胞内CD69
第八管：6）样本 CD4+胞内CD69
第九管：2）样本 CD4+胞内CD69
以上四管处理方法：
每管加100ul刺激后的细胞，按说明书加入适量的CD4，室温避光孵育15min。
用2ml预冷PBS洗一次，300g离心5min，弃上清。
涡旋打散沉淀后加入 固定剂 工作液，混匀，4℃避光孵育60分钟。
加2ml破膜剂工作液（eBioscience）或PBS（Invitrogen）洗一次，300g离心5min，弃上清
可以重复6-7步一次，最后管内残留液体尽量少，倒出液体后用吸水纸蘸干。
加入破膜剂工作液100ul，同时加入适量的CD69抗体。
离心洗涤细胞并弃去上清液。
重复上一步洗涤细胞。
用500ul PBS重悬细胞，上机检测。
4、结果处理：
不加阻断剂的样本，胞外CD69表达为90%以上
加阻断剂的样本，胞内CD69表达为90%以上，则选择此时的刺激剂浓度作为最佳浓度。
5、Th1/Th2/Th17检测步骤，请参照胞内CD69的染色，即把CD69抗体换成同型对照或者相应的细胞因子抗体即可。
