酶联免疫吸附分析 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA是以体外抗原抗体反应为基础，将抗原抗体特异性反应与酶的高效催化作用相结合的一种检测方法，灵敏度可达皮克(pg/mL)水平。它是目前商业应用最为成熟的免疫分析方法之一，在医学实验、临床诊断、生物制药方面的运用也极为广泛。目前，常见的ELISA类型有四种：双抗夹心法、直接法、间接法和竞争法。
其中，双抗夹心法是最为常用的一种，分双抗体夹心和双抗原夹心。下面小科将以双抗体夹心法为例，和大家分享相关知识~
实验原理
双抗体夹心法，其基本原理是将定量的包被抗体以物理吸附的方法固定于微孔板表面，然后加入待检标本，通过加入检测抗体，酶标记第二抗体后用TMB底物显色，微孔板中颜色的深浅与待测物的浓度呈正相关。
1 包被抗体
许多物质可作为固相载体，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纤维素等，在进行抗体固定化之前，需要对酶标板材进行筛选。酶标板由亲水到疏水，对蛋白的结合会由强变弱，造成吸附能力的差异。将抗体吸附在固相载体表面时，要求纯度要好，吸附时一般要求pH在9.0～9.6之间。蛋白质包被的最适浓度需进行滴定：用不同的蛋白质浓度包被后，在其它试验条件相同时，观察阳性标本OD值，选择OD值最大而蛋白量最少的浓度。
2 标准品及样本
标准品即为目标物（样本中待检测因子）的纯蛋白，从母液稀释到级联稀释都需要特别留意，标曲的制作是ELISA实验成功的关键。待检目标物需具备多个抗原表位，即二价或二价以上的大分子抗原，因为这种检测方法需要两种抗体。另外，需要注意的是血清样本中的类风湿因子（RF）干扰——RF能与多种动物的变性IgG的Fc部分结合而产生假阳性反应。
3 洗涤液
ELISA操作中会涉及到多次洗板。长时间的孵育后，会出现非特异性结合，这时就需要洗涤液来洗去非特异性结合的蛋白或抗体，通常为PBS，洗4-6次，每次30s左右。多次短时间洗板比少次长时间洗板更有效，在最后一次洗板时，尽量拍净液体，同时注意让板子保持湿润。
4 检测抗体
双抗体夹心法中的检测抗体与目标蛋白结合位点需要有别于目标物与包被抗体结合的位点，即会涉及抗体配对的问题。常用的抗体配对方法有下几种：
- 包被抗体为单抗，检测抗体为多抗；
- 包被抗体为单抗，检测抗体为单抗，但这两种单抗针对的抗原表位不同；
- 包被抗体为多抗，检测抗体为多抗，这两种多抗一般来源于不同的宿主。
5 生物素标记的二抗
鉴于酶标二抗的局限性，现在厂家一般引入生物素亲和素系统(biotin avidin system, BAS)，这种系统在提高反应灵敏度的同时，应用起来也更加方便。进行生物素标记时，可依据抗体所带可标记基团种类（氨基、醛基、巯基等）以及分子酸碱性选择相应的活化生物素和反应条件。生物素标记后，不影响被标记物的生物活性。
6 辣根过氧化物酶（HRP）标记的亲和素
每个亲和素分子可与4个生物素分子结合，所以可以偶合更多连接生物素的酶分子，从而大大提高了ELISA实验的灵敏度。生物素和亲和素间的亲和力强，二者一旦结合，就极为稳定，而且这种结合反应时间比抗原抗体反应所需时间短。在BAS检测中多用链霉亲和素“streptavidin, SA”，它是链霉菌培养过程中的分泌物，由4条相同的肽链组成。HRP灵敏，稳定，比活性高，分子量小，纯酶容易制备。其有4对半胱氨酸形成的二硫键，99位Asp和123位Arg形成的盐桥，9个潜在的糖基化位点，有两个金属中心，可催化显色底物TMB产生蓝色一价物。
7 显色底物
由于 TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯胺）比其他显色底物具有更高的灵敏度且无致癌性、故而被广泛使用。HRP 或其他适当过氧化物酶能在过氧化氢存在下催化TMB生成可溶的蓝色物，此时通常可在 370nm 测定吸光度。当显色反应被酸性溶液终止后，产物由蓝色一价物转为黄色二价物，此时可在 450nm 测定吸光度。
实验步骤概要
- 准备好所有的试剂和梯度稀释的标准品。板条加入300μl 1×洗液静置浸泡30秒。
- 标准品孔加入100μl 2倍倍比稀释的标准品。血清/血浆：空白孔加入100μl标准品稀释液; 细胞培养上清: 空白孔加入100 μl培养基。
- 血清/血浆：样本孔加入50μl 1×检测缓冲液和50μl 样本 细胞培养上清：样本孔加入100μl细胞培养上清。
- 每孔加入50μl 1:100稀释的检测抗体。步骤2、3、4 在15分钟内完成。
- 封膜，室温孵育2小时。洗涤6次。
- 每孔加入100μl 1:100稀释的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素。
- 封膜，室温孵育45分钟。洗涤6次。
- 每孔加入100μl显色底物，避光，室温孵育5 - 30分钟。
- 每孔加入100μl终止液。
- 30分钟内，在450nm波长检测OD值，参考波长570nm或63nm
彩蛋
任何事物都不是完美的，ELISA方法看上去很完善，在实际应用上也不可避免得存在些问题。首先，酶标板与抗体之间不是化学连接，而是通过范德华力，静电引力，疏水作用和π-π堆积的方式将抗体吸附在其表面。故酶标板无法牢固地将抗体包被在其表面。经历后续孵育，洗板过程，难免会将已经吸附上的抗体洗掉，增加了实验操作的不确定性。其次，包被抗体和抗原之间，检测抗体和包被抗体之间存在的识别作用也比较复杂。抗体抗原之间不是一对一识别，而是一个抗原可以连接多个抗体，一个抗体理论上也可以连接多个抗原。目标物和检测抗体中间经过了两次识别过程，这使得二者的识别对应关系变得更为复杂。这种情况下，检测信号和待测样浓度也不是一对一关系了。商业检测试剂盒中采用96孔板的方式就是为了通过多次实验消除一些误差。但是相对于常规免疫实验而言，ELISA具有明显优势，可谓蛋白定量的“金标准”。
