http://www.liankebio.com/article-information_Tech-680.html
作者：QIANG官网 发布日期：2015-03-06 12:00
| 何为RNA? RNA是具有多种不同的功能的生物大分子。信使RNA（mRNA）是DNA转录得到的，用做蛋白质合成的模板。蛋白质的合成是由核糖体完成的，核糖体由核糖体RNA（rRNA）和蛋白质组成。用于蛋白合成的氨基酸，是通过转运RNA（tRNA）输送到核糖体上的。RNA分子也是参与RNA转运过程的核糖蛋白的一部分。非编码RNA也是非常重要的。它们是不翻译成蛋白质的功能RNA分子。这样的RNA分子包括tRNA、rRNA、核仁小RNA（snoRNA）、微小RNA（miRNA）、小干扰RNA和piwi-interacting RNA（piRNA）。它们通常在基因表达的调控中发挥作用。 
miRNA是一类内源性的（自然产生的），约18–24个核苷酸大小的非编码RNA，在转录后的基因调控中发挥作用。一个miRNA可能在每个细胞中有超过105个拷贝，但是从每个细胞中总RNA质量的角度来看，这些RNA又是微不足道的。由于它们非常短，因此通常需要特别的分离和分析方案。 一个典型的快速生长的哺乳动物细胞培养中,每个细胞大约含有10–30 pg的RNA，而一个完全分化的原代细胞中，RNA的量要少得多——大约每个细胞中RNA的含量小于1 pg。细胞中的RNA分子主要是tRNA和rRNA。mRNA大约占细胞中RNA总量的1–5%，但是具体的量取决于细胞类型和细胞的生理状态。一个动物细胞中，大约有360,000个mRNA分子，组成了大约12,000个转录本，一个典型转录本的长度大约为2 kb。一些mRNA分子占到了总mRNA的3%，而其它的mRNA分子的含量低于0.01%。这些“稀有的”或者“低丰度”的mRNA分子在每个细胞中只有5–15个拷贝。但是，这些稀有的mRNA大约有11,000种，占到了mRNA数量的45%。 一个生物体中的基因是相对固定的，因此，mRNA的组成代表了在给定的条件下，基因的表达方式。使用杂交技术，包括RNA印迹法（northern印迹）和微阵列分析，或RT-PCR技术、转录本测序技术（RNA-seq）对RNA进行分析，能够充分反映一个生物体中的基因表达谱。但是，与DNA相比，RNA相对不稳定。这很大程度上是由于存在会降解RNA分子的核糖核酸酶(RNases)。 核糖核酸酶非常的稳定，不需要辅因子，在非常低浓度的时候就有很高的催化效率，并且不容易失活。核糖核酸酶的污染可以来自于人类的皮肤和携带有细菌和霉菌的尘埃颗粒。因此，RNA的分离和分析需要特别的技术。一个典型人类细胞的RNA含量
在一个典型哺乳动物细胞中RNA的分布
基于丰度的mRNA分类
不同细胞和组织中的RNA含量
* 由于物种、发育阶段和生长条件的不同，含量有可能不同。 microRNA 小RNA（miRNA）是一类内源性的（自然产生的），约22个核苷酸的非编码RNA分子，它们参与转录后的基因调控。它们与siRNA分子具有类似的特征。 miRNA分子在很多生物学过程中发挥了重要作用，包括细胞的分化和发育，细胞信号转导和对感染的应答等。大量的证据显示，miRNA表达的紊乱是一些疾病发生的原因和标志，包括多种癌症。在血清和血浆中可检测到无细胞的miRNA分子，而疾病会导致它们表达水平变化。这些发现，使得无细胞miRNA的表达很可能作为疾病诊断和预防中的生物标志物。 miRNA和siRNA的途径都与双链RNA相关，但是这些RNA分子的来源不同。与诱导RNA干扰的双链RNA不同，miRNA是由基因组编码的。除此之外，miRNA的前体（pre-miRNA）不完全是双链的，而是包含有双链区域的发卡结构。与RNAi不同（参考RNAi），miRNA的作用主要是调节细胞自己的基因。人类具有超过2000种miRNA分子，据估计，它们调节超过三分之二的人类基因。 miRNA系统是调节基因表达的内源性机制。成熟的miRNA分子，主要通过翻译抑制来调控内源性基因的表达。除此之外，miRNA能通过快速的脱腺苷化作用和去除帽子来摧毁mRNA。自然生成的miRNA分子的结合位点，通常在目标mRNA 3’端的非翻译区。在动物的miRNA分子中，序列的部分匹配给确定真正的结合位点带来困难，并且降低了结合位点确定的准确性。 miRNA模拟物和抑制剂 miRNA 模拟物是化学合成的，双链RNA分子（通常长度为18–24个核苷酸），通过转染到细胞中，模拟成熟的内源性miRNA分子。miRNA抑制剂是单链（通常长度为21–25个核苷酸），经过修饰的RNA分子，通过转染到细胞中，特异性的抑制miRNA的功能。模拟物和抑制剂包含一些化学修饰，以便提高活性或者增强其在体内的稳定性。 通过将miRNA模拟物转染到细胞中，并进行下游的基因表达分析或者表型分析，可以阐明特定miRNA分子的目标和发挥的作用。这些实验可以研究单个miRNA错误调节所造成的生物学影响，也能用于确定某个miRNA分子的特异性靶标基因。miRNA转染之后，如果降低或者提高基因的表达水平，说明研究的miRNA参与调节了这个基因的表达。类似的，miRNA在很多通路中的作用，都可以通过检测miRNA模拟物或者抑制剂转染之后的特定表型来研究。 miRNA模拟物/抑制剂转染对于下游应用的影响，通常可以通过如下方案来分析： ♦ 携带有报告基因，比如荧光素酶，和一个或者多个位于3’端非翻译区的miRNA结合位点的质粒载体做为miRNA的靶标。miRNA的模拟物/抑制剂与载体共转染到细胞中。在转染之后，进行报告基因检测实验，比如荧光素酶检测实验。通过将上述转染的结果与只转染质粒载体的结果比较，确定miRNA模拟物和抑制剂的影响。 ♦ 将miRNA的模拟物/抑制剂转染到细胞中，然后检测相关的内源性基因（即所研究的miRNA分子的靶标）的表达。通过将结果与未转染的细胞或者转染了阴性对照的细胞的表达结果相比，可以确定miRNA模拟物/抑制剂的作用。由于miRNA通常抑制目标基因的翻译，而不降解目标基因的转录本，因此，一般通过检测蛋白的表达水平来确定基因的表达水平，比如通过蛋白质印迹法。这意味着miRNA模拟物/抑制剂的影响通常不能通过定量的real-time PCR 来检测。 siRNA和RNAi siRNA小干扰RNA（通常称做siRNA）参与多种生物学过程——最常见的是RNA干扰或者RNAi。大多数RNA是单链的，但是，siRNA由两条互补的核酸链组成，与DNA类似。siRNA的长度大约为20–25个核苷酸。siRNA在RNAi过程中扮演了重要角色，它们通过互补的核苷酸序列来干扰特定基因的表达。长度为21个核苷酸的双链siRNA分子的一些近似值： ♦ 20 µM的siRNA相当于浓度大约为0.25 µg/µl ♦ 长度为21个核苷酸的siRNA的分子量大约为13–15 µg/nmol RNAiRNA干扰（或者RNAi）是细胞中的一种自然发生的过程，它能够关闭或者沉默特定基因的活性。RNA干扰于1998年被发现，现在已经是研究基因功能的强大工具。RNAi通过干扰信使RNA（mRNA）所携带的信息发挥作用，从而抑制蛋白的合成。mRNA失去活性，基因也就失活了。诱导RNAi的双链RNA分子（siRNA），在进入细胞之后，被Dicer酶切割成小的片段。这些小的片段，作为引导物，引导siRNA与具有互补序列的mRNA相结合。然后，这些细胞内的mRNA被切割，从而有效地破坏了它们所携带的信息，并且沉默相应基因的表达。
|
