活菌PCR技术浅析-QIAGEN微生物研究

传统 PCR 法的缺陷

传统 PCR 法的一个主要缺点就是无法分辨存活和死亡的微生物。这会导致误导性结果的生成，例如高估污染水平。此外仅对于存活微生物，传统方法也无法胜任精确的定量检测工作（图 3）

图3. 传统的 PCR 技术无法区分存活和死亡的微生物。我们制备了热灭活和存活沙门氏菌的混合样本。裂解细胞并抽提DNA。运行传统的实时定量 PCR 检测。未检出不同细胞混合物之间的 CT 值差异。这表明传统 PCR 方法无法分辨存活和死亡微生物的 DNA。

PMA 对存活和死亡细胞具有高效的分辨能力

PMA 选择性地进入死亡细胞，由光激活进而嵌入 DNA 并与之共价结合，从而在后续 PCR 中强烈抑制扩增反应。由死亡细胞 DNA 获得的 CT 信号显著高于存活 DNA，据此实现存活和死亡细胞的明确区分（图 4）。

图 4. PMA 抑制了死亡细胞 DNA 的扩增反应。使用缓冲蛋白胨水配制多种浓度的死亡沙门氏菌样本，并制备了 PMA处理组样本和非处理组样本。实验中发现 PMA 处理组的 CT值相比未处理组发生了明显的上移，ΔCT 平均值为 11.4 左右。这表明 PMA 抑制了死亡沙门氏菌 DNA 的进一步扩增。在沙门氏菌 PMA 处理组中未见到像非处理组那样的 CT 值滴定效应，这可能是由于样本中较低的拷贝数范围处于所使用的 mericon Salmonella spp Kit 的检测下限所致。

PMA 选择性抑制死亡细胞 DNA 的检测

当使用存活和死亡微生物的混合样本时，PMA 可选择性地抑制对死亡细胞的检测，而不会对存活细胞 DNA 的检测造成影响（图 5）。样本中的死亡细胞不会影响 PMA 的性能。因此可确信，所得到的结果能够精确反映样本中的存活微生物。

图 5. 在存活和死亡细胞的混合样本中，死亡细胞 DNA 的检测仍选择性地受到抑制。左侧的柱状图代表了缓冲蛋白胨水中的存活沙门氏菌细胞。右侧的柱状图则相应代表了以10:90%、50:50%、90:10% 和 100:0% 等不同比例混合的存活与热灭活（死亡）沙门氏菌样本。结果证明两组的 CT值之间存在高度的一致性（CT 值变异度低于 1）。这就印证了 PMA 可有效抑制死亡沙门氏菌检测，也说明 PMA 能够针对存活和死亡细菌的混合样本提供高水平的分辨能力。

PMA 对存活和死亡细胞具有高效的分辨能力

PMA所具有的存活和死亡细胞分辨能力，能确保您可以轻松、绝对肯定地衡量自身灭菌控制措施的有效性。比较存活和死亡沙门氏菌混合样本的 PMA 处理组与未处理组 CT 值差异（ΔCT）时，我们发现，较高 CT值的最大信号位移可达 15 左右。这一显著性的信号分离事件可用于明确区分 PMA 结合的死亡细胞 DNA 与 PMA 未结合的存活细胞 DNA。而这一分辨能力在样本中存活细胞比例变化较小的情况下仍然有效。这将确保您可以轻松并绝对、肯定地衡量自身灭菌控制措施的有效性。

图 6. PMA 提供了高效的存活和死亡细胞区分能力。这里显示了在存活和死亡沙门氏菌混合样本中 PMA 处理与非处理组之间 CT 值的差异。包含 100% 死亡沙门氏菌的样本在PMA 处理条件下，相比未处理组发生了幅度为 15 左右的CT 值上移。PMA 介导的信号淬灭效应是非线性的，在存活细胞的检测中它将显著增加，并因此导致 CT 值相对未处理组发生大幅降低，进而增大了全局性的分辨敏感度。

PMA 技术在混浊介质中实现高效检测

使用光激活化合物时存在的一个问题是，如何在性能不够理想的浑浊介质中实现细胞活性检测。好在，激活 PMA 所使用的波长能够穿透浑浊介质。

我们在一项针对李斯特菌的分析配置中加入了对照 DNA（掺入（spiked-in）DNA），以确保 PMA 试剂的效能和实现正确操作。PMA 处理组与非处理组样本之间对照 DNA CT 值的比较结果可用来证实 PMA 试剂的效能及操作的正确性。图 7 显示了 PMA 存活 / 死亡细胞区分流程的检测结果，这些结果中包含了对热灭活与存活李斯特菌混合样本中靶标通道和对照 DNA（对照通道）的检测。在靶标通道中，存活李斯特菌样本PMA 处理组与非处理组之间 CT 值不存在差异，这与实验预期一致。在死亡李斯特菌样本中引入 PMA 处理会导致 CT 结果值出现预期性上升，这是 PMA 成功嵌入 DNA 的后续结果（图 7A）。在对照通道中，掺入到李斯特菌样本中的 DNA 显示了预期为 6 左右的的 CT 值移动，其移动范围仍处于特定的 6±2 区间内，说明该结果并未受到所使用的 Nutella®介质影响（图 7B）。

这些数据清晰证明了 PMA 的激活光强足以穿透混浊样品，并能成功介导 DNA 的嵌入反应。

图 7. 匀质介质对 PMA 存活 / 死亡细胞区分能力的影响。nA 将存活或热灭活的李斯特菌掺入2.5% Nutella 基质中，并单独进行处理。存活李斯特菌在 PMA 处理组与非处理组之间未显示 CT 值改变。死亡李斯特菌样本的 PMA 处理组显示了预期中的 CT 信号位移，表明对 DNA成功完成了嵌入性修饰。nB 将对照 DNA 加入含有相同 2.5% Nutella 基质的存活或死亡细胞样本中。存活或死亡细胞的背景未对对照 DNA 的检测造成显著影响，这些检测结果中仅对应体现 PMA 的存在与否。6 左右的 CT 值移动仍就存在，并符合预定 6±2 的变动范围。这些数据提示了该应用中的 PMA 激活光强足以穿透混浊样品，并能成功介导 DNA 的嵌入反应。