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作者:联科生物 发布日期:2016-08-08 13:00
样本制备是Western实验的第一步,也是决定实验成败的关键步骤,获得的蛋白质样品必须均质、可溶,并解离成单个多肽亚基,且尽量减少相互间的聚集,使其最终仅依赖本身的分子量大小进行分离。常见的Western样本来源有重组蛋白、细胞和组织等,基本步骤可以分为三步:第一步获取材料,提取目的蛋白;第二步蛋白定量;第三步制备电泳上样样品。首先我们介绍第一步:蛋白提取。
蛋白提取的总原则和注意事项: 2. 保持蛋白处于溶解状态(通过裂解液的pH盐浓度,表面活性剂,还原剂等的选择); 3. 提取过程防止蛋白降解、聚集、沉淀、修饰等(低温操作,加入合适的蛋白酶和磷酸酶抑制剂); 4:尽量除去核酸、多糖、脂类等干扰分子(通过加入核酸酶或采取不同提取策略); 5:样品分装,长期于-80℃保存,避免反复冻融。 细胞裂解 2. 吸尽PBS,加入预冷的裂解液(1ml per 107 cells/100mm dish/150cm2 flask); 3. 用细胞刮子刮取贴壁细胞,将细胞及裂解液温和地转移至预冷的微量离心管中; 4. 4℃摇动30mins; 5. 4℃,12000rpm离心20mins; 6. 轻轻吸取上清,转移至新预冷的微量离心管中置于冰上,即为蛋白样本,弃沉淀。 组织裂解 2. 将组织放在圆底微量离心管或EP管中,加入液氮冻结组织于冰上匀质研磨,长期可保存于-80℃; 3. 每5mg加入约300ul预冷的裂解液,冰浴匀浆后置于4℃摇动2小时,裂解液体积与组织样本量有适当比例(最终的蛋白浓度至少达0.1mg/ml,理想的蛋白浓度应为1-5mg/ml); 4. 4℃,12000rpm离心20mins,轻轻吸取上清,转移至新预冷的微量离心管中置于冰上,即为蛋白样本,弃沉淀。 Western样本制备相关产品—细胞裂解液
注:膜蛋白提取优选RIPA裂解液(强)或SDS裂解液。 Western样本制备相关产品—蛋白酶抑制剂
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