小鼠骨髓来源树突状细胞培养法-Inaba 法(改良)

2. Inaba 原法操作比较复杂，需要将骨髓中的淋巴细胞等用抗体+补体法预先去除，后来的改良法均省却了这个步骤，其实 Inaba 后来自己也说这个步骤虽然可提高BMDC 的纯度，但不会对 BMDC 的生成产生影响，可做可不做；

3. Inaba 原法仅用 GM-CSF 来诱导 BMDC 的产生，虽然得到的 BMDC 在混合淋巴细胞反应中有较强的刺激能力，但 DC 的成熟度不及 GM+IL-4 的联合诱导，所以后来的改良法中多用 GM+IL-4 联合诱导。
【培养步骤】1.小鼠骨髓细胞的获得
1.1小鼠(6 - 10 周龄)颈椎脱臼法处死，手术取出所有股骨(femurs)和胫骨(tibias)，并剪刀和镊子将骨周围的肌肉组织尽量去除干净；注：不要损伤到骨。

1.2将骨移至超净台内，并用盛有 70%酒精的无菌培养皿浸泡 2-5min，以消毒灭菌，然后用无菌的 PBS 洗 2 次；

1.3将骨移入另一个盛有 PBS 的新培养皿中，用剪刀剪去骨两端，再用注射器抽取 PBS，针头分别从骨两端插入骨髓腔，反复冲洗出骨髓至培养皿中，直至骨完全变白；

1.4收集骨髓悬液，用 200 目尼龙网滤去小碎片和肌肉组织；

1.5滤过液 1200 rpm 离心 5min，弃上清；

1.6加入 2 ml 氯化铵红细胞裂解液(1x)，重悬细胞，室温孵育 3-5min，最长 10min；
氯化铵红细胞裂解液的配制：
(a)先配制10x的贮存液，配法如下：

称取82.9g NH4Cl，10.0gKHCO3和0.37g Na2EDTA，溶于1L的蒸馏水中，0.22?m滤膜过滤除菌，4oC储存6个月；

【注】可根据需要配制适量的10x贮存液，其中各组分需成比例增减。

(b)临用前，将10x贮存液用无菌蒸馏水1 : 9稀释成1x工作液即可。

【注】因氯化铵红细胞裂解液对骨髓细胞有一定的伤害作用，所以要尽量缩短溶血时间。

1.7加入 10 ml PBS 中和裂解液的作用，然后 1200 rpm 离心 5min，弃上清;

1.8PBS 洗 1 次，然后用含 10% FBS 的 RPMI 1640 培养液重悬细胞，至此已获得小鼠骨髓细胞。
2.BMDC 的诱导分化
2.1步骤 1 中获得的小鼠骨髓细胞计数后用含 10% FBS 的 RPMI 1640 完全培养液调整细胞浓度为 0.5-1 x 106/ml；

2.2铺至 24 孔培养板内，每孔 1ml 细胞，同时加入重组小鼠 GM-CSF (20ng/ml)和 IL-4 (10ng/ml)，37℃，5% CO2 培养箱培养，此为培养的第 0 天；

【注】

(1) 一般一只小鼠大约可收获 4-5 x 107 个骨髓细胞，所以可以铺至少 40-50个 24 孔板板孔。

(2) GM-CSF 和 IL-4 的使用浓度区间分别为 20-50ng/ml 和 10-40ng/ml。

2.3每 2 天轻轻摇晃培养板，然后 3/4 体积更换新鲜培养液，并补足细胞因子。

【注】

(1)此步骤的目的是去除粒细胞和淋巴细胞，因粒细胞和淋巴细胞为悬浮生长；

(2) Inaba 认为培养的前 4 天，大部分 DC 贴壁仍较牢，所以此法不会大量损失 DC；

(3) 若发现损失的 DC 细胞过多，可仅在培养的第 2 天用此法换液；

(4) 在培养的第 4 天，可以看到聚团生长的 DC 贴附于板底，第 6 天则可观察到很多 DC 成集落生长。

2.4在第 5 天和第 8 天之间，轻柔吹打培养液，收集悬浮细胞及巯松贴壁生长的细胞；

【注】

(1) 最佳收集时间是培养的第 6 天；

(2) 此时的细胞已经是 BMDC，但成熟度不高，所以需要后续的再铺板（subculture）步骤使其更成熟；

(3) 吸出培养液(含 DC 细胞)的 24 孔培养板需补充新鲜的含重组小鼠GM-CSF (20 ng/ml)和 IL-4 (10ng/ml)的 RPMI 完全培养液，继续培养，以便后面能够再次收集 BMDC。

2.5 1200 rpm 离心 5min，弃上清；

2.6 用含 10% FBS 的 RPMI 1640 完全培养液重悬细胞并计数，然后调整细胞浓度至 1 x 106/ml，并加入重组小鼠 GM-CSF (20 ng/ml)和 IL-4 (10ng/ml)；

2.7 细胞铺板至 100 mm 培养皿(每皿最多 10ml)或 6 孔培养板(2m/孔)。

2.8 37℃，5% CO2 培养箱继续培养 1-2 天；

2.9收集悬浮细胞，即为较成熟的 BMDC。

【注】

(1)第 2.5-2.8 步为再铺板(subculture)步骤，目的是使第 2.4 步获得的 BMDC更加成熟。

(2)再铺板后的 3h 内可见许多棘状贴壁细胞从 DC 簇中迁移出来，而培养1 天后会发现这些贴壁细胞从培养板底脱离，而且可以看见在培养液中漂浮着许多典型的 DC。
3、BMDC 的完全成熟
【注】步骤 2 中获得的 BMDC 并非完全成熟的 DC，若想得到完成成熟的 DC，还需 LPS，CD40L 或 TNF-a 等的诱导。

3.1步骤 2.4 或 2.9 中获得的 BMDC 以 1200rpm 离心 5min，弃上清；

3.2用含重组小鼠 GM-CSF (20 ng/ml)和 IL-4 (10ng/ml)的 RPMI 完全培养液重悬沉淀，计数后调整细胞浓度为 1 x 106/ml；

3.3加入 24 孔培养板中，并加入成熟诱导剂，如 TNF-? (250U/ml)，LPS (1?g/ml)、或 CD40L(1?g/ml)等；

3.4 37℃，5% CO2 培养箱培养 2 天；

3.5收集悬浮细胞及疏松贴壁生长的细胞即为成熟树突状细胞