【背景】
1. 该法可在 7 天内获得 30-40 x 106 个 DC/小鼠，是 Inaba 经典方法的 7-10 倍。DC经 14.5%甲泛葡胺(Metrizamide)梯度离心后，纯度(即 CD11c+/I-Ab+细胞)可达85-95%。
2. 该法获得的 DC 的内吞能力弱于 Inaba 经典方法，但分泌的 IL-12p70 量相似；
3. 该法获得的 DC 在混合淋巴细胞反应中比 Inaba 经典方法呈现更强的刺激能力；
4. 该法获得的 DC 能引起更强的特异性 T 细胞反应；
5. 以上结果提示，该法比经典方法能获得更多、更成熟的 BMDC。
【培养步骤】
1. 小鼠骨髓细胞的获得见BMDC培养Inaba 法(改良)中的相应步骤。
2. BMDC 的大量制备
2.1步骤 1 中获得的小鼠骨髓细胞计数后用含 10% FBS 的 RPMI 1640 完全培养液调整细胞浓度为 2 x 105/ml；
2.2铺至 6 孔培养板内，每孔 5ml 细胞，同时加入重组小鼠 GM-CSF (1000U/ml)和 IL-4 (1000U/ml)，37℃，5% CO2 培养箱培养；
【注】
1) 作者试探了 125U/ml、250U/ml、500U/ml 和 1000U/ml 四个细胞因子浓度，发现浓度越低，BMDC 细胞产量和成熟度越低，所以仍建议用1000U/ml。
2) 笔者认为，1000U/ml 是一个非常高的浓度，会导致培养成本过高。
2.3在培养的第 4 天，向培养体系中补充重组小鼠 GM-CSF (1000U/ml)和 IL-4(1000U/ml)；
【注】向培养体系中直接补充细胞因子而不换液的目的是避免出现任何细胞损失，以获得最大量的 DC。笔者认为，培养过程中必然会出现培养液发黄的情况，如果不换液而只是添加细胞因子，细胞很快会因为营养不够而死亡。所以笔者建议在第 4 天和第 7 天时将培养液半量或 3/4 量吸出，离心后加入含足量 GM-CSF 和 IL-4 的新鲜培养液重悬细胞沉淀，然后再将细胞放回至原板。
2.4培养的第 7 天收集 DC，用 2-4ml RPMI 1640 完全培养液重悬，加至等体积的14.5%(w/v) 甲泛葡胺上，1200 x g 室温离心 20min；
【注】此时的 DC 为不完全成熟的 BMDC，要想进一步成熟，请跳至步骤 3。
2.5收集中间层，并用 RPMI 1640 完全培养液洗 3 次备用。
3. BMDC 的完全成熟
3.1 步骤 2.4 中收集的 BMDC，重新铺板，并向培养体系中加入重组小鼠 GM-CSF(1000U/ml)和 IL-4 (1000U/ml)，以及 LPS (1-10ìg/ml)
3.2 37℃，5% CO2 培养箱培养 2 天，获得成熟的 BMDC。
