磷酸化蛋白做West Blot 实验小妙招

? 加一抗后最好4度过夜，保证抗体有充分的结合时间，因为磷酸化的蛋白只占总蛋白量的极少部分；

? 选择优质的磷酸化抗体，所以要选好的厂商，Novus为全球高端抗体品牌，其磷酸化抗体效果不错；

? 抗体的稀释倍数要优化，可以根据厂商建议进行优化；

? 用含5% BSA的TBST稀释抗体，不要用常见的5% -Fat Milk的TBST；

? 磷酸化蛋白WB时背景也往往较深,所以压片时间要适当,不能太长或过短,太长则背景太深盖住想要的那条条带，时间过短则可能没有条带或者条带太浅.；

? 磷酸化蛋白WB时,用TBST洗时也要注意一下,摇床的转速不要太快,洗的时间不要太长,孵育一抗和二抗之后分别洗5min 3次即可,宁愿背景深一些,总比做不出来强得多.另外，洗的时候，最好不要把几张膜叠在一起洗。