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作者：PeproTech官网 发布日期：2013-11-18 12:00
LIF的英文全称为Leukemia Inhibitory Factor，中文译为白血病抑制因子，其为一种具有多种功能的细胞因子，但其最重要的应用是维持小鼠胚胎干细胞的未分化状态。为帮助您更好的选择和使用LIF，特与大家分享此文。  1. LIF是如何发现的？LIF从发现、克隆到现在(2013年)已经有25年的历史了，与PeproTech公司同龄(PeproTech公司成立于1988年，今年是其25周年庆)。 那么LIF是如何被发现的呢？这要从白血病的治疗说起。 我们知道，正常的血液细胞是终末分化的细胞。存在于骨髓或外周血等处的微量造血干/祖细胞经过增殖和分化后可成为成熟的血液细胞，以不断补充死去的成熟血液细胞。如果造血干/祖细胞的增殖、分化过程受到异常调节，这些细胞将停留在幼稚的细胞阶段，而数目仍在不断增加，这就是白血病的成因。因此，白血病是造血细胞的增殖和分化过程失去正常的控制而形成的。科学家一直在寻找能够促进白血病细胞分化，同时又能抑制其增殖的细胞因子或药物，以期治疗白血病[1]。 19世纪80年代已发现了一些调节造血细胞增殖和分化的细胞因子，如G-CSF(粒细胞集落刺激因子)、M-CSF(巨噬细胞集落刺激因子)、GM-CSF(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)，Multi-CSF(即现在的IL-3)和IFN-?(干扰素-??)等。这些细胞因子的共同特点是：既能促进造血细胞的分化，又能刺激它们的增殖。这就带来一个问题，即这些细胞因子在促进白血病细胞分化的同时，也会大量增加白血病细胞的数量，这样可能会加重白血病的病情，而不是治疗白血病。所以，科学家试图仍然需要找到一种只诱导白血病细胞分化，但不促进白血病细胞增殖的细胞因子来治疗白血病。 1969年在从SL品系小鼠的自发髓系白血病体外建系(即后来我们所熟知的小鼠M1髓系白血病细胞系，常用于重组LIF蛋白的生物活性检测)的过程中，研究人员发现，正常细胞的培养液可诱导M1白血病细胞系分化为成熟的巨噬细胞或粒细胞。研究人员将培养液中的这些未知的诱导成分统称为Differentiation Stimulating Factor, 即分化刺激因子，简称D-factors (D-因子)[2]。 1981年[3]年和1984年[4]科学家分别从小鼠Krebs肉瘤细胞和小鼠 L929成纤维细胞的培养液中鉴定出MGI-2(Macrophage and Granulocyte Inducing-2, 巨噬细胞和粒细胞诱导-2)和一种D-因子，两者均可诱导小鼠M1髓系白血病细胞的分化，而不刺激正常造血细胞的增殖。 紧接着在1987年，澳大利亚皇家墨尔本医院沃尔特与伊丽莎医学研究所(Walter and Eliza Hall Institute (WEHI), Royal Melbourne Hospital)的Donald Metcalf实验室从小鼠Krebs肉瘤细胞培养液中分离出可以诱导小鼠M1髓系白血病细胞分化的蛋白，因该蛋白具有抑制M1髓系白血病细胞增殖的作用，因而被命名为白血病抑制因子，即Leukemia Inhibitory Factor (LIF)。同时发现，该蛋白不能刺激正常髓系前体细胞的增殖。 Donald Metcalf等认为LIF与前面所发现的MGI-2和D-因子是同一种物质，因他们最大的共同点是均可诱导小鼠M1髓系白血病细胞向巨噬细胞分化。至此，LIF蛋白被正式发现和命名，MIG-2和D-因子为其别名。随后，Donald Metcalf实验室分别于1987年和1988年克隆出表达小鼠LIF和人LIF的基因[5,6]。 LIF的发现似乎给人们治疗白血病带来希望。然而深入的研究发现，LIF的作用非常广泛，即使对于白血病细胞系，也是有些抑制，有些促进。因此，LIF与其它多功能的细胞因子，如TNF-?等相似，很难应用于临床。这些年来，LIF颇受关注。血液学家、神经生物学家、肌肉细胞生物学家、骨生物学家、内分泌生物学家和生殖生物学家都在研究LIF，可惜没人能够做深[7]。LIF目前最广泛的应用还是在实验室里用来培养小鼠胚胎干细胞，这在后面会详述。 2. LIF怎么和小鼠胚胎干细胞(Murine Embryonic Stem Cells, mES)的培养联系上的呢？ 1981年剑桥大学的Martin Evans，Matthew Kaufman和美国加州大学旧金山分校(UCSF)的Gail Martin等首先从小鼠胚胎内细胞团(Inner Cell Mass, ICM)中获得小鼠胚胎干细胞(mES)[8,9]的时候，必须在饲养层细胞(feeder cells)上进行培养，否则mES就会自发分化。 为分析饲养层细胞抑制mES分化的机制，人们从饲养层细胞的培养上清中分离出能够抑制mES分化的成分[10,11]。但这些成分的抑制分化作用均弱于英国爱丁堡大学医学院(University of Edinburgh Medical School)的Austin Smith于1986年从Buffalo大鼠肝脏细胞培养上清中分离出来的DIA(differentiation-inhibiting activity)，即分化抑制活性蛋白[12]。后来，Austin Smith转到英国牛津大学工作，并继续研究DIA。1988年与美国Genetics Institute公司合作，Austin Smith在探讨DIA是否可作用于ES细胞以外的细胞时，发现DIA能够维持DA-1a (小鼠IL-3依赖的白血病细胞系)的持续生长[13]。凑巧的是，美国Genetics Institute公司新近刚克隆出一个能维持DA-1a细胞生长的造血生长因子基因，命名为HILDA(Human Interleukin for DA cells)。更重要的是，序列分析发现，HILDA基因与澳大利亚Donald Metcalf实验室于同一年刚刚克隆出来的人LIF(hLIF)基因[6]序列一致，也就是说HILDA就是LIF[14]。美国Genetics Institute公司的这两个工作连续发表在Nature杂志1988年的同一期中。 鉴于DIA和HILDA/LIF均能够维持DA-1a的生长，Austin Smith就在想，HILDA/LIF是否也能和DIA一样能够抑制mES的分化。结果是令人振奋的！即将HILDA/LIF基因克隆进入非洲绿猴COS肾细胞中进行表达，COS细胞的培养上清可抑制mES细胞的分化。而且，考虑到DIA蛋白与HILDA/LIF蛋白的分子量也相近。因此推测，DIA应该就是LIF[13]。 上面的研究最重要的是发现了LIF可能就是能够抑制mES分化的DIA，也揭示了LIF对不同细胞系具有不同的作用，甚至是截然相反的作用。对小鼠M1白血病细胞，LIF可促进其分化，而对于mES，LIF则抑制其分化。 估计国外科学家之间的沟通是非常多和及时的。同期，发现小鼠和人LIF的澳大利亚Donald Metcalf实验室也敏锐地意识到DIA与LIF的相似性，并证实LIF(无论是人LIF，还是小鼠LIF)能维持mES的未分化状态[15]，该研究结果与美国Genetics Institute公司的两个工作发表在1988年Nature杂志的同一期上。也就是说，Nature杂志1988年的同一期连续刊登了3篇关于LIF的文章，且都是讲LIF与mES细胞培养的关系，可见LIF在mES细胞培养中的重要性。 因此在1988年底，也就是人的LIF刚刚被克隆出来的时候，人们就将目光转向了LIF在mES培养中的作用。此后，没人再去验证DIA与LIF是否真为同一种物质，因只要得到了一种能够强力抑制mES分化的因子(即LIF)就足够了。 3. 培养mES(小鼠胚胎干细胞)，应该用人的LIF(human LIF, hLIF)，还是小鼠的LIF(murine LIF, mLIF)? 1) 性能 hLIF和mLIF的发现者--澳大利亚Donald Metcalf实验室研究证实，hLIF对小鼠M1髓系白血病细胞的诱导分化能力与mLIF相同或更好[6]，也就是说hLIF完全可以替代mLIF来培养小鼠细胞。 更重要的是，1988年Donald Metcalf在Nature上馔文专门比较了hLIF和mLIF在维持mES细胞未分化状态的能力，发现两者完全一致，且最适用量均为1000 units/ml[15]。 有趣的是，hLIF可完全替代mLIF作用于小鼠细胞，但反过来，mLIF却对人的细胞无效。这是什么原因呢？ 研究表明，hLIF可与小鼠细胞上的mLIF受体(mLIF-R)结合，且亲合力高于mLIF与mLIF受体的结合，这可能是hLIF对小鼠M1髓系白血病细胞的诱导分化能力比mLIF更好的原因。而mLIF不能与人细胞上的hLIF受体(hLIF-R)结合。 所以mLIF不能用于培养人的细胞[16]。 综上所述，hLIF和mLIF在培养mES上的性能完全相同，可以相互替代，也就是说，完全可用hLIF来培养mES。 2) 价格 hLIF和mLIF的价格相差很大，主要原因是mLIF属于专利产品，为一家公司独有，其价格要高出hLIF 2-3倍之多。 Donald Metcalf等发现mLIF和hLIF，以及后期有关LIF的研究工作都是在澳大利亚AMRAD公司的资助下进行的，因此在后来申请专利时，发明者(Inventors)是Donald Metcalf实验室的人员，但受让人(Assignee，即专利的持有者)是澳大利亚AMRAD公司。后来，AMRAD公司自己在研制LIF药物，而将mLIF的专利权授权给另外一家公司仅用于科学研究。 从表1中可以看出，hLIF比mLIF便宜很多，且有大包装以及无动物成分(Animal Free)的hLIF可供选择，因此从性价比考虑，培养mES最好用hLIF。
3) 与其它动物的交叉反应 我们知道，目前商品化的LIF以人和小鼠为主，其它种属的LIF很难买到。因此，如果您除了研究小鼠的ES(胚胎干细胞)或iPS(诱导多能干细胞)，同时还研究其它动物，如牛、猪、犬、羊的ES或iPS，则不得不选用hLIF或者mLIF。 究竟是应该用hLIF，还是mLIF呢？国际上的标准是根据hLIF和mLIF与其它种属动物LIF的同源性高低来确定。表2显示，hLIF与牛、猪、犬、羊的LIF的氨基酸序列一致性均明显高于mLIF，因此国际上通常用hLIF来培养这些动物的ES或iPS[17-20]。
总而言之，从性价比以及与其它种属的交叉反应来考虑，用hLIF是明智的选择。 4. 奇怪的现象：hLIF对mES有效，而对hES(human ES，即人ES)的培养无效? 依培养mES的经验，在最初hES细胞的培养体系中也加入了hLIF以抑制hES的分化。但结果与预期的相悖，即hLIF无法维持hES细胞的未分化状态。原因何在？ 最初，人们推测hLIF不能抑制hES分化的原因是hES细胞表面缺乏hLIF的受体[23]。但美国加州大学圣地亚哥分校(UCSD)的Rohan Humphrey于2004年证实hES细胞上存在hLIF的受体，且hLIF与hES上的受体结合后可以激活JAK/STAT信号传导途径[24]。理论上如果JAK/STAT3信号传导途径被激活了，应该与hLIF或mLIF作用于mES相似，hES也应该保持未分化状态。但结果确是，hES仍然会分化。所以该文作者认为，hES细胞的分化状态与hLIF是否激活hES细胞的JAK/STAT3信号传导途径无关。 其实，不单是hES，LIF对猴(rhesus monkey)和兔(Rabbit)的ES也无效[25, 26]。 问题是，什么因子可抑制这些种属ES(包括人、猴和兔的ES)的分化呢？答案是FGF-basic，即碱性成纤维细胞生长因子，又称FGF-2。文献[26-29]对FGF-basic在维持这些ES细胞未分化状态中的作用进行了详述。
注：mES对FBS的质量非常敏感，请务必使用ES细胞验证过的FBS。 二、hES(人胚胎干细胞)的维持培养液 (有饲养层培养)
三、 hES(人胚胎干细胞)的维持培养液 (无饲养层培养) 为保证培养的最佳效果，最好使用商品化的hES无饲养层培养液，如PeproTech公司的PeproGrow-ESC人胚胎干细胞培养液，其优点为：
PeproGrow-hESC胚胎干细胞培养液：
应用范围：用于体外。不能用于诊断或治疗。 四、 hLIF培养mES细胞的主要文献
五、文中提及的细胞因子(PeproTech公司提供) PeproTech公司作为世界上最大的一家重组细胞因子和蛋白生产商，可提供500余种细胞因子产品，完全可满足您进行干细胞研究的各种需求。品质高、价位低是我们奉行的一贯原则。 下面的表格中仅列出本文所提及的细胞因子产品。若您还需要了解更多的细胞因子信息，请访问我们的官网：联科生物或与PeproTech(派普泰克)中国代表处联系。
Human FGF-basic (人碱性成纤维细胞生长因子)
Murine FGF-basic (小鼠碱性成纤维细胞生长因子)
Rat FGF-basic (大鼠碱性成纤维细胞生长因子)
Human TGF-β1 (人转化生长因子-?β1)
【参考文献】 2、 Ichikawa Y. Differentiation of a cell line of myeloid leukemia. J Cell Physiol. 1969; 74(3):223-34. PMID: 4187945 3、 Lipton JH, Sachs L. Characterization of macrophage- and granulocyte-inducing proteins for normal and leukemic myeloid cells produced by the Krebs ascites tumor. Biochim Biophys Acta. 1981; 673(4):552-69. PMID: 7013820 4、 Tomida M, Yamamoto-Yamaguchi Y, Hozumi M. Purification of a factor inducing differentiation of mouse myeloid leukemic M1 cells from conditioned medium of mouse fibroblast L929 cells. J Biol Chem. 1984; 259(17):10978-82. PMID: 6469994 5、 Gearing DP, Gough NM, King JA, Hilton DJ, Nicola NA, Simpson RJ, Nice EC, Kelso A, Metcalf D. Molecular cloning and expression of cDNA encoding a murine myeloid leukaemia inhibitory factor (LIF). EMBO J. 1987; 6(13):3995-4002. PMID: 3127201 6、 Gough NM, Gearing DP, King JA, Willson TA, Hilton DJ, Nicola NA, Metcalf D. Molecular cloning and expression of the human homologue of the murine gene encoding myeloid leukemia-inhibitory factor. Proc Natl Acad Sci U S A. 1988; 85(8):2623-7. PMID: 3128791 7、 Metcalf D. The unsolved enigmas of leukemia inhibitory factor. Stem Cells. 2003; 21(1):5-14. PMID: 12529546 8、 Evans MJ, Kaufman M. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 1981;292:154-6. PMID: 7242681 9、 Martin GR. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 1981; 78(12):7634-8. PMID: 6950406 10、 Smith TA, Hooper ML. Medium conditioned by feeder cells inhibits the differentiation of embryonal carcinoma cultures. Exp Cell Res. 1983; 145(2):458-62. PMID: 6861901 11、 Koopman P, Cotton RG.. A factor produced by feeder cells which inhibits embryonal carcinoma cell differentiation. Characterization and partial purification. Exp Cell Res. 1984; 154(1):233-42. PMID: 6468525 12、 Smith AG, Hooper ML. Buffalo rat liver cells produce a diffusible activity which inhibits the differentiation of murine embryonal carcinoma and embryonic stem cells. Dev Biol. 1987;121(1):1-9. PMID: 3569655 13、 Smith AG, Heath JK, Donaldson DD, Wong GG, Moreau J, Stahl M, Rogers D. Inhibition of pluripotential embryonic stem cell differentiation by purified polypeptides. Nature. 1988; 336(6200):688-90. PMID: 3143917 14、 Moreau JF, Donaldson DD, Bennett F, Witek-Giannotti J, Clark SC, Wong GG. Leukaemia inhibitory factor is identical to the myeloid growth factor human interleukin for DA cells. Nature. 1988; 336(6200):690-2. PMID: 3143918 15、 Williams RL, Hilton DJ, Pease S, Willson TA, Stewart CL, Gearing DP, Wagner EF, Metcalf D, Nicola NA, Gough NM. Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 1988; 336(6200):684-7. PMID: 3143916 16、 Owczarek CM, Layton MJ, Metcalf D, Lock P, Willson TA, Gough NM, Nicola NA. Inter-species chimeras of leukaemia inhibitory factor define a major human receptor-binding determinant. EMBO J. 1993;12(9):3487-95. PMID: 8253075 17、 Rodríguez A, De Frutos C, Díez C, Caamaño JN, Facal N, Duque P, García-Ochoa C, Gómez E. Effects of human versus mouse leukemia inhibitory factor on the in vitro development of bovine embryos. Theriogenology. 2007; 67(5):1092-5. PMID: 17210172 18、 Eckert J, Tao T, Niemann H. Ratio of inner cell mass and trophoblastic cells in blastocysts derived from porcine 4- and 8-cell embryos and isolated blastomeres cultured in vitro in the presence or absence of protein and human leukemia inhibitory factor. Biol Reprod. 1997; 57(3):552-60. PMID: 9282990 19、 Luo J, Suhr ST, Chang EA, Wang K, Ross PJ, Nelson LL, Venta PJ, Knott JG, Cibelli JB. Generation of leukemia inhibitory factor and basic fibroblast growth factor-dependent induced pluripotent stem cells from canine adult somatic cells. Stem Cells Dev. 2011; 20(10):1669-78. PMID: 21495906 20、 Fry RC, Batt PA, Fairclough RJ, Parr RA. Human leukemia inhibitory factor improves the viability of cultured ovine embryos. Biol Reprod. 1992; 46(3):44. PMID: 1617019 21、 Thomson JA, Itskovitz-Eldor J, Shapiro SS, Waknitz MA, Swiergiel JJ, Marshall VS, Jones JM. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 1998; 282(5391):1145-7. PMID: 9804556 22、 Shamblott MJ, Axelman J, Wang S, Bugg EM, Littlefield JW, Donovan PJ, Blumenthal PD, Huggins GR, Gearhart JD. Derivation of pluripotent stem cells from cultured human primordial germ cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998; 95(23):13726-31.PMID: 9811868 23、 Rose-John S. GP130 stimulation and the maintenance of stem cells. Trends Biotechnol. 2002; 20(10):417-9. PMID: 12220903 24、 Humphrey RK, Beattie GM, Lopez AD, Bucay N, King CC, Firpo MT, Rose-John S, Hayek A. Maintenance of pluripotency in human embryonic stem cells is STAT3 independent. Stem Cells. 2004; 22(4):522-30. PMID: 15277698 25、 Thomson JA, Kalishman J, Golos TG, Durning M, Harris CP, Becker RA, Hearn JP. Isolation of a primate embryonic stem cell line. Proc Natl Acad Sci U S A. 1995; 92(17):7844-8. PMID: 7544005 26、 Honda A, Hirose M, Ogura A. Basic FGF and Activin/Nodal but not LIF signaling sustain undifferentiated status of rabbit embryonic stem cells. Exp Cell Res. 2009; 315(12):2033-42. PMID: 19331817 27、 Xu, R.H., Peck, R.M., Li, D.S., Feng, X., Ludwig, T., and Thomson, J.A. Basic FGF and suppression of BMP signaling sustain undifferentiated proliferation of human ES cells. Nat. Methods. 2005; 2:185-190. PMID: 15782187 28、 Levenstein, M.E., Ludwig, T.E., Xu, R.H., Llanas, R.A., VanDenHeuvel-Kramer, K., Manning, D., and Thomson, J.A. Basic fibroblast growth factor support of human embryonic stem cell self-renewal. Stem Cells. 2006; 24:568-574. PMID: 16282444 29、 Byrne JA, Mitalipov SM, Clepper L, Wolf DP. Transcriptional Profiling of Rhesus Monkey Embryonic Stem Cells. Biol Reprod. 2006; 75(6):908-15. PMID: 16943365 30 http://www.microscopyu.com/articles/livecellimaging/livecellmaintenance.html 31 Welshons WV, Wolf MF, Murphy CS, Jordan VC. Estrogenic activity of phenol red. Mol Cell Endocrinol. 1988; 57(3):169-78. PMID:3402660 |
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