MTT 实验心得体会

实验原理：

MTT 法又称 MTT 比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性 MTT 还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。在一定细胞数范围内， MTT 结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、 细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。

实验步骤：

1. 接种细胞：用含 10% 胎牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔合适的细胞数量接种到96孔板，每孔体积 180 ul。

2. 培养细胞：同一般培养条件，可根据试验目的和要求决定培养时间。

3. 呈色：每孔加 MTT 溶液（5 mg/ml 用 PBS 缓冲液 pH=7.4 配制）20 ul。继续孵育 4 小时，终止培养，小心弃去孔内培养上清液，对于悬浮细胞，需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加 150ul DMSO，振荡 10 分钟，使结晶物充分融解。

4. 比色：选择 490 nm 波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果。

影响实验关键因素：

1. 细胞消化。若消化出现问题，则会影响细胞的活性，进而影响 OD 值。对于 MDA-MB-231、MCF-7、HS-578T 等一系列容易消化的细胞，消化时胰蛋白酶中不添加 EDTA，消化时也仅需胰酶浸润数秒即可。然而，对于SW480等一系列难以消化的细胞，胰蛋白酶中需添加浓度为 0.25% 的 EDTA。

2. 接种数量。对于细胞接种数量要适宜，过小或过大均会影响 OD 值（过小细胞容易死亡，过大细胞容易生长拥挤）。

几种常见细胞的每孔接种数量如下（个人经验）

3. 培养液的弃去。一般大家喜欢用移液器吸取孔内培养液，吸取的时候要注意移液头要紧贴孔内侧壁吸取，不要触碰底部的紫色结晶。或者将96孔板倒扣于滤纸上来吸取孔内的培养液。两种方法效果差不多，根据个人喜好选择。

4. 结晶物的溶解。加入 DMSO 溶解后，将加入DMSO的96孔板放入37℃ 孵箱内孵育 10～20 min，这样有助于 DMSO对紫色结晶物的溶解（尤其在冬天）。
联科生物MTT试剂推荐：
联科生物MTT试剂提供了MTT Solvent和 Formazan Solvent，可直接使用Formazan Solvent溶解结晶物，无需自备DMSO溶液。

使用过程中，若是贴壁细胞，弃去培养基，加入与初始体积等量的Formazan Solvent。非贴壁细胞，直接在培养基中加入与初始体积等量的溶解液。