MTT法检测细胞增殖

MTT法又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。

检测步骤

◆ 1.将细胞板放置于无菌操作台中（细菌可以导致MTT比色OD值的升高）

◆ 2.在每管MTT(5 mg/每管)中加入1 mL MTT Solvent溶解。在细胞板中每孔加入10%体积的MTT溶液。
注：MTT 对光敏感。重溶的MTT溶液冻存于0℃以下时的稳定性可至少保持6个月。重溶的MTT溶液如保存于2 - 8℃超过2周，则可能会降解，导致错误的结果。

◆ 3.将细胞板放回培养箱中继续孵育3 - 4小时。做对比试验时，孵育时间需一致。

◆ 4.孵育后将细胞板从培养箱中拿出，按照下面的方法溶解产生的MTT甲臜结晶物。
a. 如果是贴壁细胞，则弃去培养基。加入与初始体积等量的Formazan Solvent。每孔的溶解液体积可能不同，但为了方便比较，总体积须保持一致。
b. 如果是非贴壁细胞先离心去除上清液，再加入与初始体积等量的Formazan Solvent。
c. 加入 Formazan Solvent后，须在1小时内完成读数。

◆ 5.在摇床中温和地振荡可增强溶解。某些情况下，尤其是细胞密度较高时，需要反复吹打使 MTT甲臜结晶物完全溶解。

◆ 6.将细胞板放置于无菌操作台中（细菌可以导致MTT比色OD值的升高）。

注意事项

◆ 1. 一般情况下，96孔培养板内贴壁细胞长满时约有105个细胞。但由于不同细胞贴壁后面积差异很大，因此，在进行MTT试验前，要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，保证MTT结晶形成的量与细胞数呈线性关系；

◆ 2. 为了得到最好的结果，细胞数量应在对数生长期进行测定。每次检测需包括不含细胞的培养基作为空白对照；

◆ 3. 细胞消化会影响细胞的活性，进而影响OD值。容易消化的细胞，消化时胰蛋白酶中不添加EDTA，消化时也仅需胰酶浸润数秒即可；难以消化的细胞，胰蛋白酶中需添加浓度为0.25%的EDTA；

◆ 4. MTT转化为甲臜是依赖于细胞类型的。由于相同细胞系不同细胞株之间的差异，以及细胞的生理状态影响，因此推荐研究者建立自己的吸光度/细胞数量曲线；

◆ 5.细菌、支原体和其他微生物污染可能会使MTT四唑环断裂，不能用该方法测定；

◆ 6. 用含15%胎牛血清培养液培养细胞时，高的血清物质会影响试验孔的光吸收值，增加试验本底。因此，一般选含小于10%胎牛血清的培养液进行。在呈色后，尽量吸净培养孔内残余培养液。

◆ 7. CCK-8法也是常见的细胞增殖检测方法，底物被细胞中的脱氢酶还原，生成黄色的产物(甲瓒)，可溶于培养基。相较于MTT，CCK-8具有如下优点：①单一组分，无需预混，即开即用；②操作简便，只需一步即可得到结果；③无需放射性同位素和有机溶剂，对细胞毒性低；④水溶液，无需换液，尤其适合悬浮细胞。

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