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作者：联科生物 发布日期：2019-10-18 08:00
 【 操 作 步 骤 】1、对于脾脏组织，采集新鲜样本后通过适当的方法制备成单细胞悬液，并去除团块，于当天进行检测。2、在每个流式管中加入 100 µl 准备好的细胞悬液，细胞数约为 1x10^6 个。3、按照细胞表面抗原染色方法标记表面抗原。按照说明书加入适量的CD4和CD25抗体（联科流式抗体用量一般是5ul）。按个人要求设置空白管、对照管、补偿管和样本管。室温避光孵育15分钟。4、用2ml流式染色缓冲液洗涤细胞，离心去上清。5、将Fixation/Permeabilization Concentrate和Fixation/Permeabilization Diluent按1:3比例制备成1×工作液（Cat# IC001组分，联科生物）。在流式管中染色，每个样本需要1ml。保存勿超过1天。6、旋涡震荡重悬细胞后加入1ml 1×Fixation/Permeabilization 工作液，并再次旋涡混匀。室温避光孵育 30 - 60 分钟。7、用蒸馏水将10×Permeabilization Buffer 稀释为1×工作液。在流式管中染色，每个样本需要8.5ml。剩余溶液在 2 - 8℃最多保存 1 周。8、无需洗涤，每管加入2 ml 1× Permeabilization Buffer（Cat# IC001组分，联科生物）。室温下 300 - 400 × g 离心 5 分钟，弃去上清。9、（可选）重复上一步操作。10、用100μl 1×Permeabilization Buffer 重悬沉淀。通常洗涤后残留的液体量就已足够。11、（可选）细胞悬液中加入2µl Anti-Mouse CD16/CD32 (2.4G2), Purified（Cat#AM016，联科生物）进行阻断，室温避光孵育 15 分钟。12、无需洗涤，加入Foxp3 抗体或同型对照（用破膜缓冲液工作液进行稀释），室温避光孵育至少 30 分钟。13、加入2ml 1×Permeabilization Buffer，室温下300 - 400 ×g离心5分钟，弃去上清。14、（可选）重复上一步操作。15、用适量体积的 Flow Cytometry Staining Buffer（Cat#S1001，联科生物）重悬细胞，并上机检测并分析。注：由于染色过程中使用了细胞固定和破膜，对比起活细胞在形态上会有一定变化，因此 FSC/SSC图中圈门时需要做一定调整。 以上说明书仅供参考，具体实验请对照厂商说明书操作。【 相 关 产 品 】
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