测序专题——微生物多样性测序

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作者：QIAGEN 发布日期：2017-07-05 09:00

在地球各种生境中，微生物表现出极大的多样性。然而由于纯培养法培养微生物的限制性，绝大多数种类的微生物并未得到了解。有数据表明，各种生境中大约只有1%的微生物是可培养的，多达99%的微生物在现有的实验条件和技术下尚未得到纯培养。从国内外目前采用的方法来看大致包括以下几类：传统的微生物平板纯培养法、DGGE/TGGE/TTGE、T-RFLP、SSCP、FISH、印记杂交、定量PCR、基因芯片、高通量测序等分子生物学方法。

微生物多样性测序是基于二代高通量技术对16S rDNA/18S rDNA/ITS等基因序列进行测序，能同时对样品中的优势物种、稀有物种以及一些未知的物种进行检测，获得样品中的微生物群落组成以及它们之间的相对丰度。具有低成本、高通量、流程自动化等优势。
哪些研究需求可以做微生物多样性测序
(1) 物种丰度值检测：

? 检测环境样本中的优势物种

? 检测环境样本中的稀有物种

? 检测特定的感兴趣的物种

(2) 不同分组样品相似性比较：

? 样本间的相似性聚类

? 不同来源的样本的差异性比较

(3) 寻找不同分组间的重要的Biomaker

? 统计分析寻找出引起不同分组差异的重要的微生物

? 寻找潜在的微生物之间的关联性

(4) 其它的可与微生物多样性相关的分析

? 外部环境的变化必然会带来微生物群落的变化，环境因子会带来哪些菌属的丰度变化，这些菌属（可能是有益菌、有害菌、功能菌）又给环境个体带来怎样的影响，这些均可做微生物多样性的检测。
测序区段选择
由于16S rDNA较长（1.5kb），我们只能对其中经常变化的区域也就是可变区进行测序。16S rDNA包含有9个可变区，分别是V1-V9。一般我们对V3-V4双可变区域进行扩增和测序，也有对V1-V3区进行扩增测序。

图 16S rDNA全长

引物序列选择
对于微生物多样性测序，建议选择如下扩增引物：

5' fd1: AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 8-27

3' rp2: AAGGAGGTGATCCAGCCGCA 1522-1541
测序平台选择
16S rDNA测序目前可以采用多种不同的测序仪进行测序，包括罗氏的454，Illumina的MiSeq，Life的PGM或Pacbio的RSII三代测序仪。不同的仪器各有优缺点，目前最主流的是Illumina公司的MiSeq，因为其在通量、长度和价格三者之间最为平衡。MiSeq测序仪可以产生2×300 bp的测序读长，一次可以产生15 Gb的测序数据远远大于其他测序仪的测序通量。