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作者：联科生物 发布日期：2019-10-22 11:00
 成熟T细胞通过TCR识别并与抗原-MHC复合物反应。TCR活化的最直接后果是信号通路的起始，这些信号通路包括诱导特异性蛋白酪氨酸激酶（PTKs）、PIP2分解、PKC活化以及细胞内钙离子浓度的升高。这些早期事件被传递到核，产生诸多效应：• 1) T 细胞克隆的扩增 • 2) 细胞表面活化标志的上调 • 3) 分化成效应性细胞 • 4) 诱导细胞毒或细胞因子的分泌 • 5) 诱导凋亡 最常用的体外刺激检测T细胞增殖的方法是用TCR的抗原或竞争性抗体活化T细胞。本方案是一个基本方法，用CD3体外刺激小鼠脾T细胞和人类外周血 T 细胞的增殖，关键参数包括细胞密度、抗体滴度和活化动力学。 一、小 鼠 T 细 胞 活 化 用包被的anti-CD3e(145-2C11) 单抗刺激小鼠T细胞；MTT法测细胞增殖。 实 验 材 料 • 1X无菌PBS • Anti-Mouse CD3ε, Functional Grade (Clone:145-2C11) (MultiSciences, Cat#AM003E) • Anti-Mouse CD28, Functional Grade (Clone:37.51)（MultiSciences, Cat#AM028） • RPMI-1640完全培养基 • 无菌的小鼠脾脏或淋巴结单细胞悬液 • 96孔平底带盖微孔板 (Corning, Cat#3596) • 刀豆蛋白A（ConA），可选 (Sigma, Cat#C5275) • MTT溶液（MultiSciences, Cat#MTT001, MTT细胞增殖检测试剂盒组分） • Formazan Solvent（MultiSciences, Cat#MTT001, MTT细胞增殖检测试剂盒组分） • 红细胞裂解液（MultiSciences, Cat# LYS） 实 验 时 间 • 2 小时包被抗体 • 20 分钟制备脾脏单细胞悬液 • 20 分钟分析设置 • 2-4 天孵育 实 验 步 骤 1. 抗体包被至微孔板： • 1) 用无菌PBS制备5-10µg/ml的anti-CD3e(145-2C11)抗体溶液，计算所需的抗体量，每个条件或样本需做复孔。例如，包被半块板（48孔板）需要2.6ml抗体溶液。若用其他抗体共刺激时，CD3抗体的浓度可以降低。 • 2) 96孔板中，每孔加入50μl抗体，空白对照孔加50μl无菌PBS。 • 3) 用ParafilmTM 膜将板封好，37℃孵育2小时或4℃过夜。 • 4) 加细胞之前，将孔内的抗体溶液吸去。 • 5) 每孔用200μl无菌PBS洗后，弃去PBS。 • 6) 重复洗一次，去除所有的未结合抗体。 2. 加细胞： • 1) 取脾脏，无菌制备单细胞悬液，溶血去除红细胞。 • 2) 计数细胞并重悬RPMI-1640完全培养基中，浓度为106/ml。根据实验需要可选择2-3x106/ml～105/ml的浓度。 • 3) 洗板结束后，每孔加200μl细胞悬液，置于潮湿的37°C, 5% CO2培养箱中。可选择加刺激对照：ConA 1-4µg/ml刺激后孵育。 • 4) 加入2-5ug/ml anti-CD28抗体溶液。 • 5) 孵育 2-4 天。可根据具体的实验进行优化。 • 6) 每孔加 20μl MTT溶液，再放回至培养箱中孵育 4 小时。 • 7) 每孔加 50μl Formazan Solvent，轻轻振荡并孵育过夜。 • 8) 第二天分光度计测定OD570和参考波长OD690。 • 9) 计算平均值和标准方差，作图。 相 关 产 品
二、 人 T 细 胞 活 化 用包被的CD3 单抗刺激人外周血单个核细胞（PBMCs）；MTT法检测细胞增殖。 实 验 材 料 • 1X无菌PBS • Anti-Human CD3, Functional Grade (Clone:OKT3)（Multiscience, Cat: AH003） • Anti-Human CD28, Functional Grade (Clone:CD28.2)（Multiscience, Cat: AH028） • RPMI-1640完全培养基 • 无菌的人PBMCs • 96孔平底带盖微孔板 (Corning, Cat#3596) • MTT溶液（MultiSciences, Cat#MTT001, MTT细胞增殖检测试剂盒组分） • Formazan Solvent（MultiSciences, Cat#MTT001, MTT细胞增殖检测试剂盒组分） 实 验 时 间 • 2-18 小时包被抗体 • 30 分钟制备人PBMCs • 20 分钟分析设置 • 2-4 天孵育 • 1) 用无菌PBS制备5-10µg/ml的anti-CD3(OKT3)抗体溶液，计算所需的抗体量，每个条件或样品需做复孔。例如，包被半块板（48孔板）需要 2.6ml 抗体溶液。若用其他抗体共刺激时，CD3抗体的浓度可以降低。 • 2) 96孔板中，每孔加入50μl抗体，空白对照孔加50μl无菌PBS。 • 3) 用ParafilmTM 膜将板封好，37℃孵育2小时或 4℃过夜。 • 4) 加细胞之前，将孔内的抗体溶液吸去。 • 5) 每孔用200μl无菌PBS洗后，弃去PBS。 • 6) 重复洗一次，去除所有的未结合抗体。 2. 加细胞： • 1) 制备 PBMCs 并重悬于RPMI 完全培养基中，浓度为106/ml。根据实验需要可选择2-3x106/ml～105/ml的浓度。 • 2) 洗板结束后，每孔加 100μl 细胞悬液，每个样本重复做3个孔。 • 3) 加入2-5ug/ml anti-CD28抗体溶液。 • 4) 37°C, CO2培养箱孵育 2-4 天。可根据具体的实验进行优化。 • 5) 每孔加 20μl MTT溶液，再放回至培养箱中孵育 4 小时。 • 6) 每孔加 50μl Formazan Solvent，轻轻振荡并孵育过夜。 • 7) 第二天分光度计测定OD570和参考波长OD690。 • 8) 计算平均值和标准方差，作图。 相 关 产 品
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