人 Treg 试剂盒操作步骤

  1. 制备 PBMC，并调整细胞浓度至 107/mL。
  2. 在每个流式上样管中加入 100 μL 准备好的细胞悬液，细胞数约为 1 × 106 个。
  3. 按照细胞表面抗原染色方法标记 CD4 和 CD25。根据说明书和抗体管上的标识确定抗体用量（一般来说是 20μL，可能随批次有差异）。按个人要求设置空白管、对照管、补偿管和样本管。4℃ 孵育 30 分钟。
  4. 用预冷 PBS 溶液洗涤细胞，300-400 g 离心 5 分钟，去上清。
  5. 用 3 倍体积的固定/破膜稀释液 稀释 固定/破膜浓缩液，制成固定/破膜工作液，注意要新鲜配制，每个样本的用量为 1mL。
  6. 旋涡震荡重悬细胞后加入 1ml 的固定/破膜工作液（Fixation/Permeabilization）（1:3 稀释好），并再次旋涡混匀。
  7. 避光 4℃ 孵育 30 分钟到 60 分钟。
  8. 将破膜缓冲液用去离子水 1:9 稀释，制成工作液。每个样本的用量为 8.5mL。
  9. 无需洗涤，直接加入 2mL 破膜缓冲液工作液（Permeabilization Buffer）300-400 g 离心洗涤细胞并弃去上清液。
  10. （可选）重复第 9 步操作洗涤细胞。
  11. 加入 100 μL PBS 重悬细胞。
  12. （封闭可选）体系中加入 2% 的大鼠血清 2 μL，室温避光孵育 30 分钟。
  13. 体系加入适量的 Foxp3 抗体，对照管中加入适量的同型对照，具体用量参照说明书，避光 4℃孵育至少 30 分钟。建议进行预实验摸索出抗体的最适浓度。
  14. 加入 2mL 破膜缓冲液工作液离心洗涤细胞并弃去上清液。
  15. 重复上一步洗涤细胞。
  16. 用适量体积的 Flow Cytometry Staining Buffer 重悬细胞，并上机检测并分析。注：由于染色过程中使用了细胞固定和破膜，对比起活细胞在形态上会有一定变化（一般是变小），因此 FSC/SSC 图中圈门时需要做一定调整。

注：以上说明书仅供参考，具体实验请对照附件厂商说明书操作。

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