流式细胞术之免疫表型分析如何染色

流式细胞术是当代最先进的细胞定量分析技术，可对多个检测目标进行多参数特性分析，具有特异性强、灵敏度高、速度快等特点。目前，流式细胞术在临床上常用于各类白血病、淋巴瘤的分型诊断及干细胞移植效果评估等领域。

细胞免疫表型分析是流式细胞术的一种重要应用，免疫表型分析实验常包括单细胞悬液制备、细胞表面抗体染色、胞内抗体染色和核内抗体染色等步骤。本期我们就来讲讲关于流式实验抗体染色的具体操作步骤。

一、表面抗体染色

¤ 细胞样本

1. 取100 μl细胞悬液（细胞计数后用流式染色缓冲液Flow Cytometry Staining Buffer调整浓度为1×107/ml）；
2. 加入适量表面抗体，室温避光孵育15 min（抗体用量和孵育条件详见抗体说明书）;
3. 加入1~2 ml流式染色缓冲液，300 g离心5 min，弃上清；
4. 用 500 μl流式染色缓冲液重悬细胞，上机检测并分析。

¤ 全血样本

1. 取一定体积抗凝全血（人100 μl，小鼠取30~50 μl）；
2. 加入适量表面抗体，室温避光孵育15 min（抗体用量和孵育条件详见抗体说明书）；
3. 按溶血素（红细胞裂解液）使用说明裂解红细胞；
4.加入1~2 ml流式染色缓冲液，300 g离心5 min，弃上清；
5. 用 500 μl流式染色缓冲液重悬细胞，上机检测并分析。
注意：如不能立即检测，用0.5 ml 0.1%~4%多聚甲醛重悬，4℃避光保存，24 h内上机分析。

二、胞内抗体染色

1.制备好细胞悬液，取100 μl（全血样本：人100 μl，小鼠30~50 μl）染表面抗体，室温避光孵育15 min，不用洗涤；
2. 加入100 μl FIX&PERM MEDIUM A固定剂，室温孵育15 min；
3. 加入3 ml流式染色缓冲液，300 g离心5 min，弃上清，涡旋振荡，使残留液体混匀沉淀；
4. 加入100 μl FIX&PERM MEDIUM B破膜剂和胞内抗体（和/或相应的同型对照），室温避光孵育15 min；
5. 加入3 ml流式染色缓冲液，300 g离心5 min，弃上清收集细胞；
6. 用500 μl 流式染色缓冲液重悬细胞，上机检测并分析。
注意：如不能立即检测，用0.5 ml 0.1%~4%多聚甲醛重悬，4℃避光保存，24 h内上机分析。

三、核内抗体染色

使用FoxP3/Transcription Factor Staining Buffer Kit，也适用于胞浆和核内蛋白的同时检测

1. 取100 μl样本，根据实验方案和产品说明书，加入适量抗体进行表面染色；全血样本孵育抗体后加入不含固定剂的溶血素（按厂家说明操作），溶血完毕；
2. 加入2 ml流式染色缓冲液，300 g离心5 min，弃去上清；
3. 配置1×固定/破膜工作液，注意要新鲜配制；
4. 每管加入1 ml固定/破膜工作液，涡旋振荡混匀，室温避光孵育30-60 min；
5. 用蒸馏水稀释配置1×破膜缓冲液；在流式管中染色，每个样本需要 8.5 ml；
6. 无需洗涤，每管加入2 ml 1×破膜缓冲液，300 g 离心5 min，弃去上清；
7. 重复步骤6（可选）；
8. 用100 μl 1×破膜缓冲液重悬细胞；
9. 加入2 μl胞内抗体来源的血清阻断，室温避光孵育15 min；
10. 无需洗涤，体系加入适量的FoxP3抗体或其他核内及胞浆抗体或等量的同型对照（抗体用量和孵育条件详见抗体说明书），振荡混匀，室温避光孵育至少30 min；
11. 每管加入2 ml 1×破膜缓冲液，300 g离心5 min，弃去上清；
12. 重复步骤11（可选）；
13. 用500 μl流式染色缓冲液重悬细胞，上机检测并分析。
注意：如不能立即检测，用0.5 ml 0.1%~4%多聚甲醛重悬，4℃避光保存，24 h内上机分析。

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