质粒抽提过程中内毒素如何去除？

内毒素，即脂多糖或LPS，是革兰氏阴性菌（如大肠杆菌）细胞膜的组成部分。细菌外膜的外层脂质部分是完全由内毒素分子所构成的。单个大肠杆菌细胞约包含两百万个LPS分子，每个LPS分子由疏水的脂质A（lipid A）部分、复杂的糖类残基阵列部分及负电性的磷酸基团所组成。因此，每个内毒素分子都具有疏水域、亲水域和电荷域，这使它在与其他分子相互作用时具有其独特的自身性质。细菌在其活性生长期向其周围微环境中散布少量的内毒素，在死亡时则释放大量内毒素。 在质粒制备的细菌细胞裂解过程中，内毒素分子被从外膜释放到溶菌液中。

内毒素对于生物学应用的影响
内毒素会对原代细胞和敏感培养细胞的DNA转染过程造成重要影响，内毒素水平的升高会导致转染效率的急剧下降。而且，使用不含内毒素的质粒DNA对于基因治疗的相关应用至关重要，因为内毒素会导致发热、内毒素性休克综合症，并会在动物和人体上激活补体级联反应。内毒素也会干扰如巨噬细胞和B细胞一类免疫细胞的体外转染实验，导致免疫反应的非特异性激活。这些效应还包括对如IL-1和前列腺素等免疫介质的诱导性合成。为了避免对实验结果的错误判断，确保塑料制品、培养基、血清和质粒DNA中均无LPS污染十分重要。
不同质粒制备方法中的内毒素污染
内毒素分子的化学结构与性质，以及它们形成胶束结构的倾向性，都使得它们容易与质粒DNA共同被纯化出来。例如，在CsCl超速离心法当中，CsCl结合的DNA很容易被内毒素分子所污染，因为在CsCl中内毒素与质粒——溴化乙锭复合物具有相似的密度。

在大尺寸DNA纯化树脂上，高分子量胶束样内毒素很类似于高分子量的DNA分子；在阴离子交换色谱法当中，内毒素分子上的负电荷能够与阴离子交换树脂相互作用，从而导致内毒素与质粒DNA被共同纯化下来。不过，质粒DNA中内毒素污染的水平很大程度上依赖于所使用的纯化方法。QIAGEN Plasmid Kit和2xCsCl梯度离心法均能够生成较低内毒素含量的高纯度DNA。硅胶悬浆法纯化出的DNA则含有显著升高的内毒素污染。使用EndoFree Plasmid Kit抽提出的DNA仅含有可忽略不计的微量内毒素（<0.1EU /µg质粒DNA）。 各种质粒制备方法的内毒素污染与转染效率*

* 宿主株系: DH5α; 质粒: pRSVcat. ;† 1 ng LPS = 1.8 EU.
‡ 使用QIAGEN plasmid Kit所制备的质粒，其转染成功率为100%。使用其他所有制备方法所得到的转染效率以QIAGEN Plasmid Kit作为基准进行比较计算。

检测内毒素
由于内毒素与鲎（Limulus polyphemus，马蹄蟹）变形细胞中的可凝蛋白之间存在凝固反应，因此历史上一般通过此凝固反应对内毒素进行检测。今天人们则使用更为敏感的光度试验（例如BioWhittaker公司所提供的动力学-QCL检测），这类方法基于对鲎变形细胞裂解液（LAL），以及一种合成的生色底物的使用。LPS污染通常以内毒素单位（EU）来表示。通常1 ng LPS对应1–10 EU。
去除内毒素
获得专利的EndoFree Plasmid制备方法在标准的QIAGEN Plasmid纯化方案中整合了对内毒素的去除步骤。使用QIAfilter Cartridge过滤中性的细菌裂解液，并加入专门的不含内毒素缓冲液（缓冲液ER）在冰上进行共同孵育。不含内毒素缓冲液能够避免LPS分子与QIAGEN-tip中的树脂结合，从而使每微克质粒DNA中含有的内毒素少于0.1EU。