通常所说的Th1、Th2是指在各种生理与病理条件下有能力分化为Th1、Th2的辅助性T细胞 (严格意义上是 Th0)。静息状态 (未受任何刺激，如人的正常生理状态)下，Th0分化为Th1、Th2的能力非常弱；当受到外界因素(如刺激素、病原体等)刺激，Th0即会向Th1、Th2等Th细胞分化，此时，通过检测分泌的细胞因子（如IFN-γ、IL-4等）实现对各类Th细胞的检测。正常情况下机体中Th1和Th2处于相对平衡的状态，当这种平衡打破时可能引起多种疾病的发生，如肿瘤、自身免疫性疾病等。

细 胞 因 子 及 功 能

Th1：分泌 IFN-γ、IL-2、TNF-α 等细胞因子，主要介导细胞免疫应答，调节细胞毒性T细胞分化和参与迟发型超敏反应；

Th2：分泌 IL-4、IL-10、IL-13 等细胞因子，主要介导体液免疫，促进B细胞增殖、分化和产生抗体。

样 本 采 集 及 制 备

—  血 液 样 本—  

小鼠血液样本一般采用眼眶后静脉丛采血法，因此法不需麻醉或处死小鼠，对小鼠的伤害小，且可重复采血，具体方法如下：

1、穿刺采用一根特制的长7～10 cm硬的玻璃取血管，其一端内径为1～1.5 mm，另一端逐渐扩大，细端长约1cm即可，将取血管浸入1％肝素溶液，干燥后使用；

2、采血时，左手拇指及食指抓住鼠两耳之间的皮肤使鼠固定，并轻轻压迫颈部两侧，阻碍静脉回流，使眼球充分外突；

3、 右手持取血管，将其尖端插入内眼角与眼球之间，轻轻向眼底方向刺入，当感到有阻力时即停止刺入，旋转取血管以切开静脉丛，血液即流入取血管中；

4、采血结束后，拔出取血管，放松左手，出血即停止。

注意事项

a、用本法在短期内可重复采血。小鼠一次可采血 0.2～0.3 mL；

b、为适用于Th1/Th2检测，需用肝素钠来处理取血管，不可用肝素锂、EDTA或枸橼酸钠。

—  脾 单 细 胞 悬 液  —

脾单细胞悬液的制备通常有两种方法，可依据自己的喜好及习惯来选择。

•  研磨法

1、小鼠用CO2处死，立即无菌取脾；

2、将脾浸入装有冷PBS的培养皿中，用钝头剪刀剪去白色的结缔组织，换入另一个装有冷 PBS的培养皿中以清洗脾脏；

3、再次换入一个装有冷PBS的培养皿中；

4、用小的弯头手术剪剪切脾脏成3 mm左右的小块；

5、用5 mL或10 mL塑料一次性注射器的尾部背面轻轻按压研磨脾脏小块，此时会看到很多脾单细胞进入PBS中。对于一只30克左右的小鼠，完全研磨脾脏后约可获得100 x 106 左右的细胞；

6、经200目筛网过滤获得单细胞悬液，用冷PBS洗涤2次，每次1000 r/min, 离心10分钟；

7、将细胞悬浮于RPMI1640(含10%热灭活FBS)中，用台酚兰染色计数活细胞数(应在95％以上)；

8、调节细胞浓度为2×106 /mL。

•  穿刺法

1、小鼠用CO2处死，立即无菌取脾；

2、将脾浸入装有冷PBS的培养皿中，用钝头剪刀剪去白色的结缔组织，换入另一个装有冷 PBS的培养皿中以清洗脾脏；

3、 用10 mL注射器的针头在脾脏表面密密麻麻穿刺；

4、用针头吸取培养皿中的PBS，用力注入脾脏中，细胞即会从小孔中流出；

5、彻底冲出脾细胞，用玻璃吸管吸取细胞悬液；

6、经200目筛网过滤获得单细胞悬液，用冷PBS洗涤2次，每次1000 r/min, 离心10分钟；

7、将细胞悬浮于RPMI1640(含 10%热灭活FBS)中，用台酚兰染色计数活细胞数(应在95％以上)；

8、调节细胞浓度为 2×106/mL。

—  淋 巴 结 单 细 胞 悬 液 —

1、小鼠用 CO2 处死，立即无菌取出腋下和腹股沟淋巴结；

2、将淋巴结浸入装有冷PBS的培养皿中，用钝头剪刀剪去脂肪组织，换入另一个装有冷PBS的培养皿中以清洗脾脏；

3、再次换入一个装有冷PBS的培养皿中；

4、用小的手术剪剪切淋巴结成3-4 mm大小的小块；

5、在培养皿中放置一个孔径为20 um的筛网，用5 mL或10 mL塑料一次性注射器的尾部背面轻轻按压小块，使得淋巴结的单细胞通过筛网进入其下面的PBS液中；

6、用冷PBS洗涤2次，每次1000 r/min, 离心10分钟；

7、 将细胞悬浮于 RPMI 1640(含 10%热灭活FBS)中，用台酚兰染色计数活细胞数(应在95％以上)；

8、调节细胞浓度为 2×106/mL。

—  刺 激 及 染 色 —

1A 、对于肝素抗凝血，取125 μl抗凝血至流式管中，加入125 μl不含血清的培养基和1μl PMA/Ionomycin Mixture (250×)和1 μl BFA/Monensin Mixture (250×)。取125 μl抗凝血和125 μl不含血清的培养基，作为对照。混匀，37℃孵育4-6小时，每隔1-2小时取出震荡混匀；
1B、 对于使用其它抗凝剂(如EDTA、枸橼酸钠)抗凝血，用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞 (PBMCs)。用含10%胎牛血清的培养基重悬沉淀，使细胞浓度为1×107/mL。取250μl PBMCs至流式管中，加入1 μl PMA/Ionomycin Mixture (250×) 和1 μl BFA/Monensin Mixture (250×)。以只含PBMCs的样本作为对照。混匀，37℃孵育4-6小时，每隔1-2小时取出震荡混匀。
1C 、对于脾脏组织，使用适当的方法制备成单细胞悬液，并去除团块。(可选)使用淋巴细胞分离液分离制备脾单个核细胞。用含10%胎牛血清的培养基重悬沉淀，使细胞浓度为1×107/mL。取250 μl细胞悬液至流式管中，加入1 μl PMA/Ionomycin Mixture (250×)和1 μl BFA/Monensin Mixture (250×)。以只含细胞悬液的样本作为对照。混匀，37℃孵育4-6小时，每隔1-2小时取出震荡混匀；
注：在我们的试验结果中，脾细胞经淋巴细胞分离液分离后能检测到更多的细胞因子，原因未知。

2 、从样本管和对照管中取100 μl细胞悬液至新的流式管中，加入5 μl Anti-Mouse CD3ε, FITC 和5 μl Anti-Mouse CD4, PerCP-Cy5.5。震荡混匀，室温避光孵育15分钟；

3 、每管加入100 μl FIX & PERM Medium A，震荡混匀，室温避光孵育15分钟；

4 、用蒸馏水将10× Flow Cytometry Staining Buffer稀释为1×，每管加入2 mL预冷1×Flow Cytometry Staining Buffer，300 g离心5分钟，弃上清；

注：液体尽量倒干净，不要有残留。

5、 每管加入100 μl FIX & PERM Medium B、5 μl Anti-Mouse IFN-γ, PE和5 μl Anti-Mouse IL-4, APC。震荡混匀，室温避光孵育15分钟。

6、 每管加入 2 mL 1× Flow Cytometry Staining Buffer，300 g离心5分钟，弃上清；

7 、每管加入500 μl 1× Flow Cytometry Staining Buffer重悬，上机检测；或者加入500 μl 1-4%多聚甲醛重悬，2-8℃避光，于24小时内检测。

上  机  检  测

1、 调节电压和补偿：推荐使用补偿微球对流式细胞仪进行电压和补偿调节。补偿微球通常比目的细胞小，在调节FSC/SSC电压和细胞设门时需要注意。

2、 正确设门以得到Th1和Th2细胞在CD3+CD4+辅助T细胞中的比例。

注：至少获取20000-30000 CD3+CD4+ T细胞。对于某一细胞因子，因品系和个体差异，分泌该细胞因子的细胞比例差异很大。为了进行统计学差异比较，请获取足够多的细胞样本。需要注意的是，PMA/Ionomycin刺激的细胞中，分泌IL-4的细胞非常低，甚至可忽略。此时，可考虑IL-4的极化培养。

结 果 示 例

使用Mouse Th1/Th2 Staining Kit进行流式检测。正常ICR小鼠的静息肝素抗凝血(A0, B0)、EDTA抗凝血来源的PBMCs (C0, D0)、脾细胞(E0, F0)和脾单个核细胞(G0, H0)染色IFN-γ和IL-4。正常ICR小鼠的 PMA/Ionomycin刺激的肝素抗凝血(A1, B1)、EDTA抗凝血来源的PBMCs (C1, D1)、脾细胞(E1, F1)和脾单个核细胞(G1, H1)染色IFN-γ和IL-4。对CD3+/CD4+细胞进行设门分析。

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