| 流式细胞术多色荧光检测是目前精细鉴定细胞亚群及分析不同细胞亚群功能的重要手段，在国际和国内均得以广泛应用。然而，面对种类繁多的荧光染料，如何知道这些染料是否适合您所拥有的流式细胞仪，以及这些染料间的颜色补偿究竟有多大呢？下面提供两个表格谨供参考，希望能给您带来一丝感悟。
表1：荧光素特性及检测滤片
| 荧光素 |
激发波长 (nm) |
发射波长(nm) |
长通滤片 |
带通滤片 |
| eFluorTM450 |
405, 407 |
450 |
-- |
440/40, 450/50 |
| Pacific Blue |
405, 407 |
455 |
-- |
440/40, 450/50 |
| eFluorTM605NC |
355, 405, 407 |
605 |
595LP |
605/40 |
| eFluorTM625NC |
355, 405, 407 |
625 |
595LP |
605/50 |
| eFluorTM650NC |
355, 405, 407 |
650 |
630LP |
660/40 |
| FITC |
488 |
518 |
-- |
530/30 |
| Alexa Fluor® 488 |
488 |
519 |
-- |
530/30 |
| PE |
488 |
575 |
550LP |
575/26, 585/40 |
| PE-Cy5 |
488 |
667 |
635LP |
670/14, 695/40 |
| PE-Cy5.5 |
488 |
695 |
685LP |
695/40 |
| PerCP-Cy5.5 |
488 |
695 |
685LP |
695/40, 710/40 |
| PE-Cy7 |
488 |
785 |
735LP |
780/60, 780/40 |
| APC |
633, 635, 640 |
660 |
-- |
660/20 |
| Alexa Fluor® 647 |
633, 635, 640 |
668 |
-- |
660/20 |
| Alexa Fluor® 700 |
633, 635, 640 |
723 |
685LP |
710/40, 710/50, 720/45 |
| APC-eFluorTM780 |
633, 635, 640 |
780 |
735LP |
780/60 |
| APC-Alexa Fluor® 750 |
633, 635, 640 |
775 |
735LP |
780/60 |
注释:
⇒ 以eFluorTM450为例: 最大激发波长为405 nm或407 nm, 最大发射波长为450 nm, 流式细胞仪检测时无需长通滤片(LP, Long Pass), 而需440/40 (即检测波长范围为440 + 20 nm)或450/50 (即检测波长范围为440 + 25 nm)的带通滤片 (BP, Band Pass)。
⇒ 以eFluorTM605NC为例: 最大激发波长为335 nm, 405 nm或407 nm, 最大发射波长为605 nm, 流式细胞仪检测时需595LP长通滤片(即大于595 nm的光可透过滤片, 而小于595 nm的光被滤片反射),和605/40 (即检测波长范围为605 + 20 nm)的带通滤片。
表2：荧光素颜色补偿参考值
| |
FITC |
PE |
PerCP-Cy5.5 |
PE-Cy7 |
APC |
AlexaFluor® 700 |
APC-AlexaFluor® 750 |
eFluorTM450 |
eFluorTM605NC |
eFluorTM650NC |
| FITC |
|
1.10 |
0.00 |
0.08 |
0.00 |
0.00 |
0.00 |
0.00 |
0.00 |
0.00 |
| PE |
16.52 |
|
0.01 |
1.62 |
0.00 |
0.00 |
0.00 |
0.00 |
0.41 |
0.00 |
| PerCP-Cy5.5 |
3.37 |
27.52 |
|
3.50 |
0.74 |
5.29 |
0.16 |
0.00 |
0.06 |
31.83 |
| PE-Cy7 |
0.27 |
2.01 |
11.48 |
|
0.11 |
0.86 |
1.86 |
0.00 |
0.00 |
0.08 |
| APC |
0.00 |
0.01 |
2.19 |
0.05 |
|
0.62 |
22.80 |
0.00 |
0.06 |
77.17 |
| Alexa Fluor® 700 |
0.00 |
0.00 |
19.35 |
0.11 |
29.46 |
|
8.84 |
0.00 |
0.00 |
5.83 |
| APC-Alexa Fluor®750 |
0.09 |
0.00 |
3.09 |
5.34 |
5.10 |
25.70 |
|
0.01 |
0.03 |
0.00 |
| eFluorTM450 |
0.27 |
0.00 |
0.00 |
0.00 |
0.00 |
0.06 |
0.22 |
|
0.15 |
0.09 |
| eFluorTM605NC |
1.51 |
16.99 |
0.00 |
0.02 |
0.03 |
0.32 |
0.00 |
1.47 |
|
6.02 |
| eFluorTM650NC |
0.24 |
1.02 |
1.43 |
0.01 |
1.06 |
0.00 |
0.44 |
0.00 |
1.02 |
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注释:
⇒ 表中数值表示各荧光检测通道间的颜色补偿值 (compensation), 单位为%。
⇒ 以FITC和PE为例：若流式细胞仪的FL1通道检测FITC, FL2通道检测PE, 则需将仪器的补偿设置为 FL1-%FL2=1.10, FL2-%FL1=16.52. 具体可理解为PE荧光素的1.10%漏到FL1检测通道, 需从FL1中减除; 而FITC荧光素的16.52%漏到FL2检测通道, 需从FL2中减除。
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