流式细胞术用于Fluo-3 AM检测胞内钙离子

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作者:联科生物 发布日期:2015-09-24 09:00

流式细胞术用于Fluo-3 AM检测胞内钙离子Fluo-3AM的原理:
FLUO-3广泛用于长波长的荧光钙指示剂。其在506NM处被吸收,可以被氩离子激光的488nm激发光激发,便于检测。FLUO-3在没有同钙结合的情况下,无荧光产生。但是,在与钙结合后,荧光(526nm)增强至少40倍。Fluo-3 AM是一种可以穿透细胞膜的荧光染料。Fluo-3 AM的荧光非常弱,其荧光不会随钙离子浓度升高而增强。Fluo-3 AM进入细胞后可以被细胞内的酯酶剪切形成Fluo-3,从而被滞留在细胞内。Fluo-3可以和钙离子结合,结合钙离子后可以产生较强的荧光,最大激发波长为506nm,最大发射波长为526nm。实际检测时推荐使用的激发波长为488nm左右,发射波长为525-530nm。
流式操作的推荐步骤:
1、收集细胞,重悬到106个细胞。

2、(可选步骤)加入丙磺舒,使终浓度达到1-2.5 mM或苯磺唑酮,终浓度为0.1–0.25 mM。(丙磺舒可提高细胞染色效率,减少Fluo-3 AM外漏)。

3、加入Fluo-3 AM,使终浓度为0.5-5 μM(具体浓度需要自己优化),20-37℃孵育15-60分钟。

4、用细胞染色缓冲液洗涤细胞三次,加入500 ul染色缓冲液,37℃ 条件下孵育 20-30 min,确保Fluo-3 AM在细胞内完全转变成Fluo-3。但需注意此时如放37C时间较长会增加fluo3从细胞的流失。

5、Fluo-3 AM的激发波长为488nm,发射波长为525nm。
正对照的设置:
关于正对照,经典使用ionomycin刺激淋巴细胞作为正对照,刺激浓度为1-2ug/ml。
具体做法是:
采集数据时用双指数直方图,x轴为时间,y轴为Fluo3(线性)。

首先收集样品大约1分钟,此时可以调节FL1电压使Fluo3基线信号在50左右或者以下。

然后软件上不中止样品的收集,但是迅速把样品管取出,往管中加 入ionomycin,混匀,然后放入采集处继续采集数据大约5分钟。此时应看到信号很快大幅度上升。

附件中图片是这个流式采集应该的样子,可以只看最左边的正对照。注意该文中FL1用的虽然是对数,但是线性的话图看起来会更好些。注意,为了去除流式仪器中残存的ionomycin或其他刺激物(以免引起下一个样品的误差),样品间最好用漂白水洗一下机子。

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