流式细胞术的各种荧光标记及其选择与搭配

一、 荧 光 素 介 绍

荧光素按激发光波长来分，主要是激发波长为375nm、405nm、488nm和633nm四类。其中，常用的是激发波长为488nm和633nm的荧光素，如FITC、PE、APC、PI等。

激发波长为488nm的荧光素

01 异硫氰酸荧光素

Fluorescein isothiocyanate，FITC是应用最为广泛的一种荧光素，经激光激发后发出明亮的黄绿色荧光，最大发射波长为525nm。FITC的荧光强度受PH影响较大，常随着PH的降低而减弱。因此，在使用FITC时需格外注意溶液的酸碱度。

02 藻红蛋白

Phycoerythrin，PE是从红藻中分离纯化获得的一种常见染料，经激光激发后发出橙黄色荧光，最大发射波长为575nm。PE具有吸光性能好和光量子产率高的特点，可用于标记表达水平较低的蛋白。在流式细胞术检测中，PE标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪。

03 Alexa Fluor 488

Alexa Fluor是美国分子探针公司开发的系列荧光染料。Alexa Fluor 488的发射光谱与FITC几乎一致，经激光激发后发出绿色荧光，最大发射波长为519 nm，但其荧光强度和稳定性要优于FITC。一般来说，Alexa Fluor 488在pH 4-10范围内能保持较好的光稳定性。

04 PE-Cy5

PE-Cy5是一种复合染料，属于藻红蛋白偶联物，在此类复合染料中，激发能量可从PE传递到Cy5上，最大发射波长为667nm。由于PE-Cy5与FITC、PE在光谱上重叠范围小，荧光干扰少，因此实验中常将PE-Cy5与FITC、PE搭配使用。需注意，PE-Cy5不适合与APC搭配使用，两者的光谱重叠范围大。

05 PE-Cy5.5

复合染料，能量从PE传递到Cy5.5上，最大发射波长为694nm。与PE-Cy5不同，PE-Cy5.5和APC之间的荧光干扰小，可搭配使用。并且，PE-Cy5.5的荧光强度要优于PE-Cy5。

06 PE-Cy7

复合染料，最大发射波长为785nm。PE-Cy7与FITC无光谱重叠，与APC重叠也较少，因此其可与FITC、PE、APC搭配使用。在实验中需要注意，PE-Cy7的光淬灭性很强，需要绝对避光环境。

07 PerCP-Cy5.5

复合染料，最大发射波长为695nm。PerCP的光量子产率较低，适用于表达水平较高蛋白的检测，而PerCP-Cy5.5光量子产率高，可用于表达水平较低蛋白的检测。在双激光管仪器上与APC共同检测时，需要做补偿调节，但比PerCP补偿少。

08 PI/7-AAD

碘化丙啶（propidium iodide，PI）和7-AAD（7-amino-actinomycin D）的最大发射波长分别为617nm和647nm，常用于细胞凋亡检测。在大部分流式细胞仪上，PI在FL2或FL3通道检测，7-AAD在FL3通道检测。7-AAD同PI有着相似的荧光特性，但其发射光谱较PI窄，对其他检测通道的干扰更小，在多色荧光分析中是PI的最佳替代品。

激发波长为633nm的荧光素

01 别藻青蛋白

Allophycocyanin，APC最大发射波长为660nm，其标记的抗体适用于所有配备氦氖激光器的流式细胞仪，检测通道一般是FL4通道。FITC、PE和APC是经典的3色搭配组合。

02 Cy5

Cy5属于小分子染料，最大发射波长为670nm，其标记的抗体适用于所有配备633nm氩离子激光器的流式细胞仪，检测通道一般是FL4通道。除流式细胞术外，Cy5同样适用于传统的荧光显微镜技术。需注意的是，Cy5与单核细胞、粒细胞的非特异性结合多，实验结果容易出现假阳性。

03 Alexa Fluor 647

Alexa Fluor 647是一种明亮的红色荧光染料，最大发射波长为668 nm，一般在流式细胞仪的FL4通道检测。Alexa Fluor 647具有光量子产率高、光稳定性好、适应的PH范围广和不易淬灭等特点，是APC和Cy5的优质替代品。

二、荧光素选择与搭配

在流式细胞术的细胞免疫学检测及免疫分型等实验中，各种荧光素偶联的抗体是必不可少的。荧光素的选择和搭配，通常会从以下5个方面进行考虑：

流式细胞仪的配置

仪器需配备可激发相应荧光素的激光管；对于多荧光素实验，仪器可同时检测多种细胞荧光。

染料的亮度与抗原表达量相适应

低表达量的抗原，推荐使用高亮度荧光素；高表达量的抗原，推荐使用低亮度荧光素。

荧光素之间的光谱重叠最小化

尽量选择光谱重叠小的荧光素组合，如FITC/PE-Cy7；选择不同激光激发的荧光素组合，如FITC/APC、PE/APC。

避免复合染料联合使用带来的假阳性

常见的复合染料有PE-Cy5、PE-Cy5.5、PE-Cy7、PerCP-Cy5.5、APC-Cy7等，复合染料的信号衰退会降低APC或PE的灵敏度。如果出现信号衰退，则：

• 减少样本暴露于光、高温或固定剂；
• 选择染料时考虑：复合染料的信号衰退会降低APC或PE的灵敏度，避免染料和其衍生物在同一细胞上标记。选择更稳定的tandem-dye（PerCp-Cy5.5）；
• 如果样本需固定，选择稳定、可有效阻止复合染料信号衰退的固定剂多聚甲醛：冰上固定10min，离心除去多聚甲醛，将样品重悬于PBS中。

尽量使用红色激光激发自发荧光高的样本

每种细胞群都有不同水平的自发荧光。所有的荧光通道均可观察到自发荧光，但自发荧光强度在波长较长时迅速降低。对自发荧光较强的细胞，选择红光激发，发射波长长的荧光素（如APC）可得到较好的S/N比值；对自发荧光比较弱的细胞，发射波长长的荧光素对S/N提高没有明显的改善，可选用FITC。

流式细胞术对荧光素的选择搭配有着很高的要求，尤其是对于多色实验来说，荧光素搭配效果直接影响到检测效果。希望上面这些知识可以更好地帮助您选择荧光素。