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作者：联科生物 发布日期：2019-03-01 09:00
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今天推出的是流式Th检测，小伙伴们一起来看看吧： 我们通常所说的 Th1、Th2 和 Th17 是指在各种生理与病理条件下有能力分化为 Th1、Th2 和 Th17 的 T辅助细胞 (严格意义上是 Th0 细胞)。静息状态 (即未受任何刺激，如人的正常生理状态)下，Th0分化能力非常弱，当 Th0 细胞受到外界因素 (如刺激素、病原体等)刺激会向 Th1、Th2 或 Th17 分化，具体分化趋向取决于细胞因子的种类。实验中检测的 Th1、Th2 和 Th17 实际上是检测 Th细胞对刺激素刺激的反应能力。 通常选用的刺激剂为PMA (佛波酯) 和 Ionomycin (离子霉素)。其中 PMA 为 PKC (蛋白激酶 C) 的激活物，PKC 则可激活下游众多的蛋白激酶的磷酸化，形成级联反应，导致许多蛋白的表达，进而引起 T 细胞的活化。在细胞内，PKC 可被 DAG (二脂酰甘油)和 Ca2+的共同作用而激活，因此在Ionomycin (Ca2+的转运剂，可将细胞器内的 Ca2+转运至胞浆内)的参与下，T 细胞内 PKC 可被进一步激活。可见，PMA 与 Ionomycin 协同活化 T 细胞。 活化的 T 细胞可分泌多种细胞因子至细胞外，而流式细胞仪仅能检测细胞内的抗原，所以应将细胞因子阻断在胞内。细胞因子在高尔基体中合成，某些蛋白通过内质网运输以可溶性形式分泌至细胞外。破坏高尔基体即可切断细胞因子的转运途径，阻断其分泌。通常选用的阻断剂为Brefeldin A (BFA, 布雷非德菌素 A)和/或Monensin (莫能霉素)。 此外，实验如何正确地设门以选定Th 细胞是很重要的。Th 细胞的表面标志为 CD3+CD4+，而当用 PMA 刺激人抗凝血 4 小时，会发现 CD4+的细胞明显减少，甚至消失，这是因为 PMA 会诱发细胞表面 CD4 分子被内吞。所以通常的做法是用 CD3 和 CD8 反设 CD4 细胞，即 CD3+CD8-的细胞被认为是CD3+CD4+的细胞。 抗凝剂的选择也会影响检测。使用肝素钠和肝素锂作为抗凝剂，不影响 Th 细胞的活化和细胞因子的分泌，而使用 EDTA 和枸橼酸钠作为抗凝剂则无法检测到细胞因子。此时，应使用 PBMCs而不是抗凝血进行刺激。 详细操作步骤请参考：小鼠Th1/Th2和Tc1/Tc2的检测
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