中国克隆猕猴今天登上Cell和各大头条

体细胞核移植技术构建的克隆猕猴“中中”和“华华”

论文上线后，旋即引起中外媒体热烈追逐，从大众传媒如美国的路透社、美联社、华盛顿邮报、CNN，CBS，NPR，国家地理杂志，英国的BBC、每日电讯、 每日邮报、中国新华社，到科学媒体如Nature, Science, New Scientists等，都第一时间对中中和华华做了刷屏的大篇幅深度报道。此前，从来没有一项中国科研成果，能够如此地刷屏外媒。为什么克隆猕猴能引起如此大的轰动呢？

背 景
非人灵长类动物，指除人以外的所有灵长类动物，在基础研究和生物医药研究领域有重要的地位。相比于大小鼠等啮齿类哺乳动物，非人灵长类与人类有着更多相似的生物学特征，被认为是研究高等认知以及脑疾病的最理想的模式动物。因此，国际科学界很早就对非人灵长类高度重视，并建立了很多非人灵长类研究中心。中国非人灵长类资源非常丰富，全国各地有多个非人灵长类动物饲养繁殖基地。国家对利用非人灵长类开展科学研究也非常重视，于2017年底出台的“中国脑计划”项目中，非人灵长类动物研究就占据非常重要的地位。

论文通讯作者、中国科学院神经科学研究所非人灵长类研究平台主任孙强介绍说：“我们克隆出的猴子模型可被用来研究很多灵长类生物学问题。此项技术能帮助科学家制备具有相同遗传背景的猴子，并对克隆猴的基因按需进行编辑，为研究人类脑部疾病、癌症、免疫系统或代谢紊乱等提供了真实可靠的模型，还可用于测试相关的治疗药物。

“中中”和“华华”并不是世界上第一个被克隆出的灵长类动物。在1999年，科学家即使用胚胎分裂技术克隆出了一只叫Tetra的猴子。不过， 该克隆技术比较简单，是基于双胞胎自然形成的模式，且一次最多只能产生四个后代。而在这项最新的研究中， “中中”和“华华”是通过体细胞核移植技术（somatic cell nuclear transfer，SCNT）构建获得。20多年前，那只叫做Dolly的小羊就是用同样的技术被克隆出的。多利羊是第一个以成体动物细胞进行复制而产生的克隆动物，意味着无需精子这类生殖细胞，运用已经分化的体细胞也能够产生和原细胞基因完全相同的子代。
什么是体细胞核移植技术呢？
首先，研究人员将卵细胞的细胞核去除，再将另一个成熟分化的体细胞的细胞核取出，通过显微注射打进卵细胞内。重构后的卵细胞继续分化发育，最终形成与细胞核供体具有相同遗传特征的动物克隆（图2）。

体细胞核移植技术成功克隆“多莉”羊

SCNT技术的生物学本质即细胞重编程（cell reprogramming）。终末分化的成熟体细胞，与具有多分化潜能的干细胞相比，其染色质的结构、基因的活性等都有很大不同。在干细胞中，多能相关基因处的染色质结构较松散，有助于这些基因的转录激活。当细胞的分化方向确定，多能相关基因失活，那些维持特定细胞类型的基因转而开启表达。

近年来，表观遗传学的研究突破帮助人们更深刻地理解了重编程的机制。知社在上周刚刚报道了清华大学丁胜教授课题组的最新研究成果（单击查看）。他们用表观基因组的定向编辑技术，研发出了一种简便快捷地制备诱导性多能干细胞（iPSC）的方法。

值得一提的是，无论是传统的SCNT，还是iPSC研究，都是实现细胞重编程、获得多分化潜能干细胞的一种手段（图3）。基于细胞重编程的iPSC研究，正是始于SCNT的启发，又有超越SCNT技术的优点。而SCNT技术的优点，也是目前的iPSC技术无法超越的。今天，SCNT技术因为“中华”猴的问世，再次成为人们关注的焦点。

两种获得具有多向分化潜能的干细胞的技术：(a) 体细胞核移植技术；(b) 诱导性重编程

在“多莉羊”之后的20多年间，同样运用SCNT制备的其他克隆动物，如牛、鼠、猪、猫、兔、马、狗、狼等，也相继诞生。那么，
为何克隆猴却迟迟不肯问世？
首先，猴子卵细胞的获取存在困难。就生殖生理特性来说，食蟹猴和恒河猴都是单胎动物，在大小鼠、牛和猪等动物中收集获得卵母细胞资源的方法并不可行。由于存在优势卵泡效应，即使是用激素对其进行超数排卵处理，所获得的卵母细胞数量仍非常有限。这种数量上的限制极大影响了非人灵长类动物克隆的成功。

不仅如此，由于SCNT本身存在的缺陷，导致通过克隆获得的重构胚胎发育效率很低。几年前，美国科学家用SCNT分别制造出了猴胚胎干细胞和人类胚胎干细胞，但是它们的发育能力十分有限。这主要是因为与其他哺乳动物的克隆相比，灵长类体细胞核对SCNT有抗性。

这种抗性在近年的表观遗传学研究中被鉴别出来，被称为重编程抗性区（Reprogramming Resistence Regions, RRRs）。在哈佛大学张毅教授的两项研究（图4）中，明确了小鼠和人的供体细胞核的基因组中均存在RRRs。在这些区域，富集着一类组蛋白甲基化修饰，阻碍了具有多分化潜能调控功能的基因表达，使得SCNT技术中的重构胚胎发育受阻。

明确了阻碍，自然就要寻求办法克服。

张毅教授研究组发现，如果向移植了体细胞核的卵细胞中引入KDM4D——一类组蛋白去甲基酶，去除这类组蛋白甲基化修饰，就能够提高重构卵细胞的重编程效率和正常发育分化能力，进而提高核移植的成功率。

在用体细胞核移植技术制备病人特异性的人胚胎干细胞的过程中，引入组蛋白去甲基化酶，能够提高重构细胞的分化效率。

此外，在之前的研究中，组蛋白去乙酰化酶抑制剂（如TSA和scriptaid）已被用于提高哺乳动物（小鼠，牛，猪，猴和人）的SCNT的成功率。组蛋白乙酰化修饰有助于打开染色质，启动多能性相关基因的表达，进而促进重编程。
克隆猴成功的秘诀有哪些呢？
中科院神经科学研究所的研究人员克服了克隆灵长类动物的挑战。他们成功的关键即在于充分利用了最新的表观遗传学成果：

完成核移植之后，研究人员向卵细胞导入了表观遗传修饰的调节因子：KDM4D和TSA，以此来启动胚胎发育的功能基因。因为导入了表观遗传修饰因子，体细胞核中原本被抑制的基因重新被激活，并最终在代孕雌猴中获得了很高比例的受孕率和正常发育率。

具体来说，在用TSA处理后又注入KDM4D mRNA的重构卵中，有44.7%发育成了囊胚。这些囊胚中又有64.7%形成内细胞团（Inner Cell Mass）。相比只使用TSA——囊胚获得率为16.7%——有很大提高。由此看来，组蛋白去甲基化酶KDM4D显著改善了SCNT的猴胚胎的表观遗传重编程，这一点与张毅教授组有关鼠和人的发现是相同的。

那么，组蛋白甲基化修饰究竟作用于供体核的哪些基因？换句话说，哪些基因的失活在阻碍重编程的进程呢？为了找到答案，研究人员用RNA测序技术，发现了可能导致SCNT克隆胚胎发育不良的基因，包括一些发育多能性相关基因如Dppa2，Dppa4和Myc，以及其他抑制基因如Zscan4和Polr3h。这些基因在胚胎发育中发挥了什么功能？如何通过操纵这些基因来促进SCNT胚胎的发育？这些谜底的揭开需要进一步的研究。

“中中”和“华华”的供体细胞核，来自同一只流产的猴胚胎的成纤维细胞，研究人员从中获得了大量遗传背景相同的细胞核。他们也尝试了使用成年猴的体细胞核作为供体，但所得的克隆猴因呼吸异常，在出生后只存活了几个小时。 由此看来，相比胚胎体细胞，成体体细胞的重编程的阻碍更大，但其具体机制还不明确。蒲慕明院士在发布会中提到，如果成体体细胞作为供体的重构胚胎再多一些，也许是会成功的。

中科院神经科学研究所的研究人员指出，他们选用胚胎成纤维细胞作为供体的另一个原因，是便于在体外对其进行基因编辑和筛选，避开CRISPR-Cas9技术的脱靶问题和嵌合体现象，进而大量获得遗传背景相同的克隆动物。

研究负责人孙强介绍说，“我们尝试了多种方法，但只有一种可行。成功得到克隆猴之前，我们经历了多次失败。” 论文第一作者刘真曾花了三年时间练习和优化SCNT技术（图5）。为了快速准确地从卵细胞中去除细胞核，促进供体细胞核和去核卵细胞的融合，他测试了多种方法。

体细胞核移植技术中的显微注射步骤（B,C,D,E,F）；重构细胞融合后正常发育为带有内细胞团的囊胚（J）。

这些优化改进操作包括：用偏振光成像系统定位并去除卵细胞的遗传物质；将核供体细胞与仙台病毒包膜（HVJ-E）一起温育；使卵细胞透明带形成激光损伤，以便于将供体细胞核注入卵周间隙（图5D、E、F）。

中科院神经科学研究所所长、该研究的合作者蒲慕明院士指出，SCNT技术的实验步骤非常精致，你操作得越快，卵细胞受到的破坏就越少。刘真博士的手很巧，很能干，但也付出了大量的实践。并不是每个人都能准确迅速地完成去核和细胞融合的操作，核移植技术的优化是我们取得这一成功的关键.

中国科学家使用体细胞核移植技术制备出克隆猴

目前，“中中”和“华华”还在喝奶（瓶喂）期，它们的生长发育与同龄猴子相比无异。研究人员也会继续关注“中中”和“华华”的身体发育和智力发展。预计未来几个月会有更多的克隆猕猴诞生。研究人员也计划继续改进技术。

在庆祝克隆猴成功之余，有待科学家解决的问题还有很多。比如，如何安全地获取胎猴的体细胞？为何成体细胞核产生的克隆猴存活时间短？不同哺乳动物重构胚胎的重编程能力差异是由哪些因素决定的？不同哺乳动物的多能相关基因的表观修饰有何差异？等等。

除此之外，人们最关心的，可能还是：
克隆猴技术所面对的伦理问题
这项动物研究工作严格遵循了美国国立卫生研究院制定的国际指南。至于在克隆非人类灵长类动物时，哪些做法可取，哪些做法不可取，孙强和蒲慕明鼓励科学界就此展开讨论。

蒲慕明院士强调，我们非常清楚这类准则的重要性，将来，无论在世界何处，如果使用非人灵长类动物进行实验，都需要科学家严格遵循道德伦理标准。

在新闻发布会上，也有多位记者就使用灵长类动物做实验的伦理问题发问。对此，蒲慕明院士表示：

“克隆猴的目的是出于其对人类医学价值的考量。现有的很多动物疾病模型与真实人类疾病表现有不同之处，猴子作为动物模型有其他动物无法比拟的优势。而且，这项克隆猴技术使得短期内（约9个月）就能获得遗传背景完全相同的一代动物，实际上最终能够减少动物的使用量。

几年前基因编辑兴起的时候，人们就其应用做过热烈讨论，出台了严格的管理规则，现在实施得比较好，收到了不错的效果。中国的动物实验也会严格遵守国际标准。希望这项工作能使更多的人认识到克隆猴作为动物模型的优越性和重要性。”

不过，相信人们还是会禁不住发问：
“克隆猴会被人类温柔以待吗？”“克隆猴已经降临，克隆人还会远吗？”……
对于这样一个科技改变世界的时代，你是充满期待还是……不寒而栗？
参考资料
1 刘真, 蔡毅君, 孙强. 非人灵长类基因修饰模型研究进展. 生物工程学报, 2017, 33(10): 1665-1673.

2 Matoba S et al.Embryonic development following somatic cell nuclear transfer impeded by persisting histone methylation.Cell. 2014, 6;159(4):884-95.

3 Chung YG et al.Histone Demethylase Expression Enhances Human Somatic Cell Nuclear Transfer Efficiency and Promotes Derivation of Pluripotent Stem Cells.Cell Stem Cell. 2015, 3;17(6):758-766.

4 Mummery CL, Roelen BA.Stem cells: Cloning human embryos.Nature. 2013,13;498(7453):174-5.

5 Loi P et al., A New, Dynamic Era for Somatic Cell Nuclear Transfer?Trends Biotechnol. 2016, 34(10):791-7.

6 Cell, Liu, Z. et al: "Cloning of macaque monkeys by somatic cell nuclear transfer"