Western常见问题分析（二）

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作者：联科生物 发布日期：2014-12-14 13:00

1、Western用的一抗，单抗好些还是多抗好些？
做Western来讲，理论上单抗比多抗的特异性要好，但单抗种类较少，一般价格偏高，所以一般来说多抗足够了。用于Western的抗体和用于ELISA的抗体，一般来说用于Western的抗体识别的是氨基酸序列特异性，而可用于ELISA的抗体要看抗原种类，有些是识别氨基酸序列特异性，有些是识别构象特异性，所以一般根据说明书来确定。做免疫印迹选择抗体主要考虑两个问题，一时所选抗体是否识别凝胶电泳后转印至膜上的变性蛋白，另一个是所选抗体是否会引起交叉反应条带。
2、半干转是否要去膜、滤纸、胶同样大小，因为胶大小不一定规则，膜和滤纸会大一点，那样会不会短路？
可以相等，但是如果纸、膜比凝胶大就比较容易形成短路了，上下两层滤纸也不能因过大而相互接触，这样会短路，电流不会通过胶和滤纸。转移前和转移过程中看看电压就行，正常的半干转是慢慢变高的，最后结束时一般是开始的1.5-3倍都是正常的。
3、Western Blot哪种染色好？
阴离子染料是较常用的，特别是氨基黑，脱色快，背景低检测极限可达1.5ug，考马斯亮蓝虽然与氨基黑有相同的灵敏度，但脱色慢，背景高。丽春红S和快绿在检测后容易从蛋白质中除去，以便进行随后的氨基酸分析。

胶体金，灵敏度高，检测范围可达到pg级，但染色稳定。

生物素话灵敏度位于1.2之间，可用于任何一种膜。
4、不能很好的将大分子量蛋白转移到膜上，转移效率低怎么解决？
可以考虑，转移缓冲液中加入20%甲醇，因为甲醇可以降低蛋白质洗脱效率，但可增加蛋白质和NC膜的结合能力，甲醇可以防止凝胶变形，甲醇对高分子量蛋白质可延长转移时间；转移缓冲液中加入终浓度0.1% SDS，也是为了增加转移效率；用优质的转移膜，或使用小孔径的NC膜，低浓度胶，提高转移电压/电流，增加转移时间。
5、DAB显色，碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶显色原理是什么。
DAB显色在辣根过氧化物酶的作用能形成一种灰褐色的终末产物，该产物难溶于醇和其他有机溶剂，DAB的氧化还能引起聚合作用，导致与四氧化锇反应而增加其染色强度和电子密度。