干货 | 基础流式知识全方位解答（二）

上篇我们学习了如何搭配流式抗体荧光标记、如何根据流式细胞仪搭配流式抗体、搭配荧光素的原则、如何解决检测的指标数超过流式细胞仪的通道数、流式检测样本如何保存、不能立即检测的抗体染色细胞该如何处理、同型对照的作用、什么情况下需要使用同型对照、如何选择同型对照、为什么有时同型对照的表达会比抗体的表达高，点击查看—— 基础流式知识全方位解答（一）

本篇将继续学习流式技术的基础知识：
1：流式染色条件？
一般推荐室温染色15分钟；或4℃染色30分钟。具体请参照抗体说明书。
2：胞内实验中，monensin（莫能霉素）的作用是什么？
Monensin是Na+的离子载体。细胞经其处理之后，Na+、H+梯度被破坏，并且高尔基体的转运和分泌被阻断，新合成的蛋白从而滞留和浓缩在细胞内。分泌型蛋白（如细胞因子IFN-γ/IL-4/IL-17a等），在做流式检测时都应提前用Monensin或者同类的BFA（布雷福德菌素）处理4个小时以上方可检测。
3：表达荧光蛋白的细胞可以固定么？
可以用4%的多聚甲醛固定10min，迅速用PBS冲洗一次，再用PBS洗3次，每次5min。
4：Annexin V可以用于检测固定组织的凋亡么？
不可以。固定过的细胞其胞膜已经受到破坏，Annexin V会结合胞膜内外的PS，因此所有的细胞都呈阳性，对分析没有意义。
5：流式染色溶液（staining buffer）配方？
一般是PBS或者PBS+ 3%FBS（胎牛血清）。
6：流式染色溶液（staining buffer）的作用和用法？
用来洗涤细胞和作为孵育抗体时的介质。有一定的消除非特异性结合的作用，可以降低检测的背景。
7：用于流式的抗体能否用于激光共聚焦？
一般情况下是可以的。但对于表达较弱的抗原，抗体标记的荧光强度不够，需要选择荧光强度高的染料，比如Alexa系列，或者用纯化的一抗+荧光二抗来做。
8：平均荧光强度（MFI）和百分比（%total、%gate）的意义？
%total或者%gate的结果代表的是百分率，即细胞占总体细胞或者是门内细胞的百分比；用百分比作为统计指标，适用于荧光表达较强的指标。如果检测样本的荧光强度不是很强，属于弱表达的指标，若用百分率统计，就会失去一部分弱阳性的数据，建议使用平均荧光强度（大多是指荧光强度的几何平均值，geomean）作为统计指标，比较荧光强度的变化。一般情况下，百分比和MFI是没有严格要求必须采用哪个指标，关键在于看你对于实验结果的解读哪个更有利；如果仅仅需要判断阳性阴性，那只需要阳性比例，但是如要同时判断不同条件对靶抗原的影响，则MFI也有重要意义。
9：流式多色配色原则：
● 仪器配置：激光器--是否可以激发待选的荧光素；检测器：是否有足够的检测器来检测所要用的荧光抗体组合；光路设计；滤光片。

● 染料的亮度与抗原表达量相匹配：高表达的抗原可用不太亮的染料，低/弱表达的抗原用亮的染料。

● 荧光染料重叠最小化：同一细胞的抗原, 用不同激光激发减少重叠；如果有可能，尽量采用多激光激发减少重叠。

● 尽量避免复合染料联合使用带来的假阳性：复合染料的信号衰退会降低APC或PE的灵敏度。（APC和PE的假阳性及补偿变大），要减少样本暴露于光、高温或固定剂中。

● 尽量使用红色激光激发自发荧光高的样本：每种细胞群都有不同水平的自发荧光；所有的荧光通道均可观察到自发荧光，但自发荧光强度在波长较长时迅速降低；对自发荧光较强的细胞，选择红光激发，发射波长长的荧光素（如APC）可得到较好的S/N比值；对自发荧光比较弱的细胞，发射波长长的荧光素对S/N提高没有明显的改善，可选用FITC。
10：为什么要使用补偿微球？
如果荧光补偿没有调节好，会导致细胞分群不明显或者流式检测得到的结果图非常不漂亮，而且会影响到检测结果的真实性。荧光补偿的调节对初学者来说非常不容易掌握，同时，补偿调节是流式细胞术中比较难掌握的操作。尤其是检测一些不常见的标志时，需要经验非常丰富的流式操作者根据多年的经验判断调节补偿，才可以得到比较好的数据和图片。

补偿微球会让一切变得更简单，它的实用性是在于克服了以往普通的做三色以上的流式分析时补偿难调、耗费样本（往往用待测样本单标来进行补偿调节）的缺点。它本身不携带任何荧光，借助于与客户自己的特异性荧光抗体孵育结合来调节补偿。它可以像待测的样本细胞一样在相同的实验条件下固定、破膜等，操作起来很简单，灵敏度高，一致性好，使补偿更轻松更准确，而且它最适合于多色分析（如五色、六色、七色等）和复合染料（如PE- Cy7、APC-Cy7等），因为这时的补偿往往难度较大。各型号的流式细胞仪均能使用。使用后可以将流式操作的条件保存，方便下次做同样的荧光染色搭配时参考用。