流式细胞术中荧光补偿该如何调节？

在讨论如何调节的问题前，我们先了解下流式实验为何需要调补偿？

荧光分子在被激发后都会发射特定波长范围的光，但是这些荧光的发射光之间会发生光谱重叠。

荧光补偿的调节是纠正荧光素发射光谱重叠的过程，即从一个被检测的荧光信号中减掉溢漏过来的其他光。

荧光发射光光谱重叠示例：

以FITC和PE为例来看光谱重叠。FITC单染管的荧光会部分漏到PE通道中，而这部分需要从PE通道中减掉溢漏过来的FITC荧光。

那么荧光补偿该如何调节呢？

1. 调节电压
2. 检测荧光通道的自发荧光
3. 每个荧光通道做单染管对照检测

何为单染管对照？

• 细胞
• 补偿微球

细胞通常是流式抗体单染管对照的样本首选，但是当细胞数量有限，无多余细胞用于抗体单染或感兴趣的表面抗原表达较低，阳性分群不明显不足以用来调节补偿时，建议选择补偿微球。

补偿调节时要注意：

• 使用未染色的细胞做PMT的电压设置
• 不要使用未染色的补偿微球设置电压

eBioscience提供两种补偿微球：OneComp eBeads与UltraComp eBeads。

微球大小和淋巴细胞相当，可连接各种荧光标记的抗体来调节补偿。每滴微球中都含有两群：一群是可以结合抗体的阳性群，一群是不会与抗体反应的阴性群。

优点：

• 使用方便，一滴即可
• 使用实验抗体与微球有效结合调节补偿，无需再用CD4分群来调节
• 细胞替代物，适应各种孵育时间，结果稳定



• 能与各种种属和亚型的抗体反应



竞争品牌的微球是分种属的，使用不同抗体要购买多个产品以使用
注：兔来源的抗体与微球结合力较弱，但某些还是可以使用

• 适用于各种激发光

适用于488 nm 蓝光，532 nm 绿光，561 nm 黄光，633-635 nm 红光，UltraComp eBeads尤其适用紫外 (355 nm) 或者 紫色 (405 nm) 激光器

• 微球本身信号经过优化适合补偿调节
• 价格相当，有小包装

操作步骤：

1. 准备好流式管，每种荧光抗体一个；
2. 将微球翻转或者涡旋混匀；
3. 在每管中加入一滴微球；
4. 在管中分别加入相应的 1 test 抗体（不同抗体 1 Test 的用量不同，具体参见说明书）；
5. 敲击或者涡旋混匀；
6. 2-8℃暗处孵育 15-30 分钟；
7. 每管加 2mL 流式染色缓冲液，400-600 x g 离心 3-5 分钟；
8. 弃上清，每管加入 0.2-0.4 mL 流式染色缓冲液；
9. 混匀后上机分析。

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