Treg细胞｜可爱又迷人的反派角色

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Treg细胞的免疫抑制除了可以帮助机体避免自身免疫性疾病，在某些肿瘤中，它也可以使机体对肿瘤细胞产生抗原耐受，从而使肿瘤细胞逃脱机体的免疫杀伤作用。不得不说，Treg细胞真的是让人又爱又恨。那么，如何对Treg细胞进行检测分析呢？

目前, 公认的区分Treg 细胞的表面标记物为：CD4+CD25+FoxP3+或CD4+CD25+CD127低表达。FoxP3是Treg细胞发育成熟和发挥功能的必要因素，是目前Treg细胞最敏感的标记，但检测FoxP3需要对细胞进行破膜，如后续实验需要上样细胞且细胞保持完整，可以CD4+CD25+CD127低表达作为Treg标志，CD127位于Treg细胞表面。
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检测步骤 —— 以CD4+CD25+FoxP3+作为标志：

1. 在流式管中加入100 μl抗凝血或1-10×106脾细胞，加入5 μl Anti-Mouse CD4, FITC和5 μl Anti-Mouse CD25, APC。涡旋震荡混匀，室温避光孵育 15 分钟。

2. 每管加入2 ml 1× FCM Lysing Solution 工作液，涡旋震荡混匀，室温避光孵育15分钟。室温下300 - 400 ×g 离心5分钟，弃去上清。每管加入2 ml 1× Flow Cytometry Staining Buffer，涡旋震荡混匀。室温下300 - 400 ×g 离心5分钟，弃去上清。

3. 每管加入 1 ml Fixation/Permeabilization工作液，涡旋震荡混匀。

4. 室温避光孵育30 - 60分钟。

5. 无需洗涤，每管加入2 ml 1× Permeabilization Buffer。室温下300 - 400 ×g 离心5分钟，弃去上清。

6. (可选)重复步骤5。

7. 用100 μl 1× Permeabilization Buffer 重悬沉淀。通常洗涤后残留的液体量就已足够。

8. (可选)细胞悬液中加入2 μl Anti-Mouse CD16/CD32, Purified进行阻断，室温避光孵育15 分钟。

9. 无需洗涤，加入5 μl Anti-Mouse Foxp3, PE 或5 μl Mouse IgG1 Isotype Control, PE。震荡混匀，室温避光孵育至少 30 分钟。

10. 每管加入2 ml 1× Permeabilization Buffer，室温下300 - 400 ×g离心5分钟，弃去上清。

11. (可选)重复步骤10。

12. 每管加入500 μl 1× Flow Cytometry Staining Buffer 重悬，上机检测。
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