Western样本制备方法之二----电泳样品制备

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作者:联科生物 发布日期:2016-08-16 14:00

Western样本制备方法之二----电泳样品制备
Western样品电泳前需进行蛋白定量,以便保证蛋白上样量一致,有利于后续定量或半定量分析,常用的蛋白浓度测定方法有Lowry法、BCA法、Bradford法等,其灵敏度和所需的时间不同,且不同的方法会受不同干扰物质的影响,实验者可以根据样本制备方法(裂解液成分、去垢剂和还原剂种类等)自行选择。以下是几种方法的比较:

方法 原理 灵敏度 干扰因素 应用
BCA法 基于双缩脲原理,碱性条件下蛋白质将Cu2+还原成功Cu,BCA螯合Cu作为显色剂,产生蓝紫色并在562nm有吸收峰,单价Cu与蛋白浓度在一定范围内呈现线性关系。 试管法: 20-2000ug/ml, 微孔法: 25-500ug/ml。 对SDS、Triton X-100、Tween 20、Tween 80等化学干扰物有很好的兼容性,但易受鳌合剂、还原剂、脂类物质及强酸、强碱条件的影响。 较快40分钟内完成, 较好, 抗干扰能力强。
Bradford法 考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合呈蓝色,在波长595nm有吸收峰,其吸光值与蛋白含量成正比。 50 - 1000 μg/ml 易受强碱性缓冲液TritonX-100,SDS等去垢剂的影响 快速5-15分钟, 颜色稳定, 深浅随不同蛋白质变化。
Lowry法 蛋白质在碱性溶液中肽键与Cu2+螯合,形成蛋白质-铜复合物,还原酚磷钼酸产生蓝色化合物,蓝色深浅与蛋白质浓度呈线性关系。 较高5ug/ml 适用于脂类含量较高的样品测定,也能耐受相当浓度的去垢剂如SDS。 40-60分钟, 操作要严格计时。

蛋白样本经过定量后,要制备电泳上样的样本,一般有以下几种情况:

A.变性、还原蛋白样本

一般的抗体只能识别抗原蛋白中的部分序列结构(表位),为使抗体能够达到结合该表位而需要将蛋白样本进行变性,使之打开折叠的空间结构。蛋白变性一般使用含阳离子去污剂如SDS的上样Buffer,并于95-100℃煮沸5分钟,SDS的阴离子环绕蛋白肽键使之带负电荷,蛋白分子量不同,结合的SDS数量不同,所带负电荷也不同,电泳迁移速度不同,SDS-PAGE电泳可以将不同分子量的蛋白分开。

B.天然和非还原样本

某些抗体识别的表位是非连续氨基酸构成的蛋白三维结构,此种情况需要进行非变性的WB,抗体的说明书一般会标注,这种非变性电泳不加SDS,样本也不需煮沸。某些抗体仅识别蛋白的非还原态,如某些Cysteine基的氧化态,因此Loading buffer和电泳液中不加入巯基乙醇和DTT。

蛋白状态 凝胶状态 Loading Buffer 电泳缓冲液
还原—变性 还原和变性 有β-巯基乙醇或DTT和SDS 有SDS
还原—天然 还原和非变性 有β-巯基乙醇或DTT,无 SDS 无SDS
氧化—变性 非还原和非变性 无β-巯基乙醇或DTT,有SDS 有SDS
氧化—还原 非还原和天然 无β-巯基乙醇或DTT,无SDS 无SDS

Western电泳样品制备相关产品:

目录号 产品名称 规格 目录价
PQ0011 BCA法蛋白定量试剂盒(50T/250T) kit 240
PQ0012 BCA法蛋白定量试剂盒(100T/500T) kit 360
PQ0021 快速型Lowry法蛋白定量试剂盒(50T/1000T) kit 150
PQ0022 快速型Lowry法蛋白定量试剂盒(100T/2000T) kit 200
PQ0031 抗干扰Lowry法蛋白定量试剂盒(50T) kit 180
PQ0032 抗干扰Lowry法蛋白定量试剂盒(100T) kit 280
PQ0041 Bradford法蛋白检测试剂盒(500T) kit 60
PQ0041 Bradford法蛋白检测试剂盒(1000T) kit 100
WB004 SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X) 1 ml*2 30
WB0041 非变性蛋白上样缓冲液(5X) 1 ml*2 30
WB0042 非变性非还原性蛋白上样缓冲液(5X) 1 ml*2 30